《蛋白質(zhì)工程》PPT課件

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1、蛋白質(zhì)工程Protein engineering,Protein engineering,蛋白質(zhì)工程是應(yīng)用科學(xué)，目的是獲得有用或有價值的蛋白質(zhì)。 這是一個年輕的學(xué)科，目前，蛋白質(zhì)工程尚未有統(tǒng)一的定義。 一般認為蛋白質(zhì)工程就是通過基因重組技術(shù)改變或設(shè)計合成具有特定生物功能的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)工程是在基因重組技術(shù)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)學(xué)科基礎(chǔ)上，融合了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動力學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和計算機輔助設(shè)計等多學(xué)科而發(fā)展起來的新興研究領(lǐng)域,蛋白質(zhì)工程進展,蛋白質(zhì)工程是發(fā)展較好、較快的分子工程。 福什特（Forsht）等在1985年間對酪氨酰tRNA合成酶的分子改造工作。1987年枯草桿菌蛋

2、白酶改造活力提高10倍。 佩里（Perry）1984年溶菌酶分子改造使酶熱穩(wěn)定性提高。 。。。。。 蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進到嶄新的時代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時期。,蛋白質(zhì)工程的前景,蛋白質(zhì)工程取得的進展向人們展示出誘人的前景。 例如，科學(xué)家通過對胰島素的改造，已使其成為速效型藥品。 生物材料科學(xué)家正積極探索將蛋白質(zhì)工程應(yīng)用于微電子方面。 用蛋白質(zhì)工程方法制成的電子元件，具有體積小、耗電少和效率高的特點，因此有極為廣闊的發(fā)展前景。,實際應(yīng)用,提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 融合蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)活性的改

3、變 治療酶的改造 嵌合抗體和人緣化抗體,蛋白質(zhì)工程的研究策略,蛋白質(zhì)工程的基本途徑,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預(yù)測 創(chuàng)造和改造,兩個戰(zhàn)略,合理設(shè)計 蛋白質(zhì)計算機設(shè)計。使用計算機的方法設(shè)計蛋白質(zhì)是最具挑戰(zhàn)性的工作。 技術(shù)： 定點突變 定向進化。,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,蛋白質(zhì)工程的核心內(nèi)容之一就是收集大量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的信息，以便建立結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的理論研究奠定基礎(chǔ)。 國外有許多研究機構(gòu)正在致力于研究蛋白質(zhì)與核酸、酶抑制劑與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，以開發(fā) 具有高度專一性的藥用蛋白質(zhì)。,結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計和預(yù)測,根據(jù)對天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析建立起來的數(shù)據(jù)庫里的數(shù)

4、據(jù)，預(yù)測一定氨基酸序列肽鏈空間結(jié)構(gòu)和生物功能；可以根據(jù)特定的生物功能，設(shè)計蛋白質(zhì)的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。通過基因重組等實驗直接考察分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系； 通過分子動力學(xué)、分子熱力學(xué)等，根據(jù)能量最低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預(yù)見將來能建立一套完整的理論來解釋結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，用以設(shè)計、預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。,計算機輔助蛋白質(zhì)設(shè)計,計算機輔助蛋白質(zhì)設(shè)計（）是指在蛋白質(zhì)工程中，應(yīng)用計算機技術(shù)，通過對已知的蛋白質(zhì)順序、分子構(gòu)象、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等數(shù)據(jù)的分機處理，預(yù)測和評估蛋白質(zhì)改造中各種方案，做出最佳選擇，

5、具體地講，是蛋白質(zhì)工程中蛋白質(zhì)設(shè)計的軟件的研究。 研究的內(nèi)容也就是應(yīng)用軟件的開發(fā)，包括數(shù)據(jù)分析處理算法的研究，蛋白質(zhì)設(shè)計模擬模型的建立以及計算機程序編寫和軟件可用性的研究,Protein design,Protein design is the design of new protein molecules from scratch, or the deliberate design of a new molecule by making calculated variations on a known structure. Protein design requires an underst

6、anding of the process by which proteins fold. by use of computer models, Protein design is also referred to as inverse folding. Hence, designing a new protein involves the identification of the sequences which have the chosen structure as free energy minimum.,蛋白質(zhì)創(chuàng)造和改造,蛋白質(zhì)的改造，從物理、化學(xué)法到基因重組。 物理、化學(xué)法：對蛋白

7、質(zhì)進行變性、復(fù)性處理，修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質(zhì)形成一定的立體構(gòu)像等等； 生物化學(xué)法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學(xué)基團，利用轉(zhuǎn)酰胺酶使蛋白質(zhì)發(fā)生膠連等等。 基因重組技術(shù)：如定位突變技術(shù)，盒式突變，PCR技術(shù),定向進化Directed evolution,定向進化是一種用在蛋白質(zhì)工程中的方法 利用定向進得到在自然界中未發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)或RNA。,定向進化實驗步驟,多樣化，Diversification: 在此步驟中常用的技術(shù)是易錯PCR和DNA改組。突變庫 選擇，Selection: 理想突變的掃描或選擇。 擴增，Amp

8、lification:確定的突變復(fù)制擴增，了解DNA序列的突變。 這三個步驟稱為一個“回合”定向進化。大多數(shù)實驗結(jié)果將執(zhí)行一個以上的回合。上一輪的結(jié)果供下輪創(chuàng)建一個新庫。在實驗結(jié)束，蛋白質(zhì)或RNA突變采用生化方法鑒定。,定向進化與自然進化,自然進化,自然進化是環(huán)境壓力下物種朝著適應(yīng)生存 環(huán)境的方向發(fā)展 自然進化是漫長時間里通過DNA復(fù)制發(fā)生突變或通過重組， 自然進化是產(chǎn)生了遺傳多樣性 自然進化是自發(fā)、非常緩慢、自然選擇,定向進化,定向進化在實驗室中模仿自然進化 定向進化的關(guān)鍵步驟：突變、重組和篩選，在較短時間內(nèi)完成漫長的自然進化過程， 定向進化有效改造蛋白質(zhì)，使之適于人類的需要。,定向進化與

9、自然進化的差別,定向進化的一般過程,酶定向進化的意義,酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。 選擇特殊環(huán)境，利用酶定向進化技術(shù)重新設(shè)計及改進酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以逐步接近和滿足將酶催化用于工業(yè)生產(chǎn)的需要。,酶分子定向進化的歷史,Sol Spiegelman在20世紀60年代利用RNA噬菌體Q進行實驗，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。,RNA噬菌體Q,定向進化的歷史,1981年，B.G.Hall等定向改變E.coliK12中ebg酶的底物專一性，開發(fā)出對幾種糖苷鍵有水解能力的酶。 1993年，Arnold研究組提出易錯PCR的

10、方法。 1994年，Stemmer將DNA重組方法引用到酶分子的定向進化中。 1999年，Stemmer等把DNA改組延伸到族改組。,定向進化的歷史,酶定向進化的過程,酶定向進化通常分3步進行： 通過隨機突變和(或)基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性； 導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫； 通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。這個過程可通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。,多樣性的產(chǎn)生,定向進化的策略,無性進化 易錯PCR、化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機誘變、 由致突變菌株產(chǎn)生的隨機突變 有性進化 DNA改組技術(shù)、隨機引物體外重組法、交錯延伸法,易錯PCR(error-prone P

11、CR),一種相對簡單、快速廉價的隨機突變方法 通過改變PCR反應(yīng)條件，使擴增的基因出現(xiàn)少量堿基錯配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機突變。 關(guān)鍵是控制DNA的突變頻率。 此法的不足之處： 靶序列長度一般在0.5-1.0kb，應(yīng)用范圍有限； 中性突變較多； 較為耗時、費力； 獲得的DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。 此法突變具有一定的密碼偏向性。,易錯PCR,連續(xù)易錯PCR(Sequential error-prone PCR),該方法是將一次PCR 擴增得到的有益突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復(fù)進行隨機誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。,DNA改組技術(shù)(DNA shuff

12、ling),又稱有性PCR，指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組。 通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能。 分子育種,DNA改組原理,1.DNaseI產(chǎn)生隨機片段；2.隨機片段變性；3.隨機片段復(fù)性；4.延伸延伸22--44步后可獲得全DNA片段片段,單個基因的DNA改組,從突變體基因庫中分離出的DNA片段用脫氧核糖核酸酶I隨機切割得到的隨機片段 經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán) 在PCR循環(huán)過程中，隨機片段之間互為模板和引物進行擴增，直到獲得全長的基因， 這導(dǎo)致來自不同基因片段之間的重組,基因家族改組技術(shù)(family shuffli

13、ng),采用基因家族的改組效果明顯高于單個基因的改組效果。 特點 改組基因的效率高 提高基因突變機率,基因家族改組,隨機引物體外重組法(RPR),交錯延伸原理,DNA改組與常規(guī)定向進化的比較,基因文庫的構(gòu)建,構(gòu)建理想的基因文庫要考慮的因素： 基因文庫的質(zhì)量 (1) 文庫的代表性 (2) 突變基因片段的序列完整性 文庫篩選可選擇的方法 控制突變庫的大小與特定的篩選容量相適應(yīng),突變體基因的構(gòu)建策略,DNA隨機酶切，片段拼接 單鏈DNA隨機拼接（提高不同親代基因的同源片段重組形成嵌合體基因的效率） 限制性酶切片段隨機拼接（防止PCR擴增產(chǎn)生相同的親代基因）,構(gòu)建突變基因文庫的載體系統(tǒng),噬菌體載體系統(tǒng)

14、基因文庫： 構(gòu)建中最早使用 插入片段的裝載容量大，適合大片段克隆 構(gòu)建出的基因文庫質(zhì)量高、代表性好 適合長期保存 主要缺點是構(gòu)建成基因文庫后，可采用的文庫篩選方法有限,質(zhì)粒載體系統(tǒng),質(zhì)粒載體系統(tǒng)： 優(yōu)點 體外操作簡便， 載體本身的設(shè)計上有很大可塑性 能實現(xiàn)對基因文庫的功能性篩選 缺點 插入片段的載體容量較小，含有長片段的重組克隆在文庫的群體擴增過程中容易丟失 轉(zhuǎn)化效率普遍較低 不適合文庫的長期保存,文庫的篩選,建立有效的搜索文庫的方法是影響定向進化成功與否的關(guān)鍵 采用的定向篩選方法必須靈敏，且應(yīng)與目的性質(zhì)相關(guān) 借助檢測儀器易實現(xiàn)高通量篩選,定向進化的篩選,活體篩選法-基于表形觀察的篩選 基于基

15、因編碼蛋白質(zhì)的檢測篩選表達文庫 噬菌體顯示法； 細胞表面顯示法（細菌、纖毛蟲細胞表面） 篩選方法根據(jù)各個蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)，篩選方法根據(jù)各個蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)因此，不具有通用性。 突變體基因篩選能否成功的關(guān)鍵是將基因的表型和能通過定量表征的篩選手段緊密聯(lián)系。 為加快分離目的基因的過程，已建立起多種在基因發(fā)現(xiàn)上具有“高通量”性能的篩選方法。,高通量篩選技術(shù),突變微生物分離 瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 微球細胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個細胞附著在單個固體珠上，突變體進行分離和篩選。 流式細胞計數(shù)法:細胞經(jīng)熒光染色后，

16、通過 高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細 胞計數(shù)儀進行測定。,酶活力檢測,反應(yīng)產(chǎn)物：顯色pH指示劑顯色pH指示劑顯色，分光光度計和熒光酶標(biāo)儀 通過檢測底物消耗或產(chǎn)物生成進行終點檢測：GC/HPLC，使用較短的柱子以縮短分析時間 同位素標(biāo)記底物：質(zhì)譜 熱力學(xué)紅外檢測,噬菌體顯示篩選模式,pH指示劑顯色高通量篩選,產(chǎn)物顯色篩選,熒光產(chǎn)物篩選,基于比色法和熒光檢測的高通量篩選,蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實例,胰蛋白酶 金屬硫蛋白 人白細胞介素-2 組織纖溶酶原激活因子 枯草桿菌蛋白酶,組織纖維蛋白溶酶原激活因子,組織纖維蛋白溶酶原激活因子(t-PA)是一種血漿糖蛋白，其功能是將單鑰活性形式的血淺纖溶酶原（plg)激活，轉(zhuǎn)變成纖溶酶。溶解血栓，目前進行t-PA蛋白質(zhì)工程的研究主要是構(gòu)建長半衰期的t-PA 突變體。通過改變t-PA 分子中的某些糖基化的氨基酸而減少或避免糖基化，可減緩在血漿中被清除的速率，從而獲得具有更長半衰期的治療藥劑。,枯草桿菌蛋白酶,枯草桿菌蛋白酶是重要的工業(yè)用酶。朱榴琴等人采用定點突變和隨機突變的方法，對枯草桿菌堿性蛋白酶E基因進行改造，突變后的基因插入大腸桿菌枯草桿菌穿梭質(zhì)粒中，在堿性和中性蛋白酶缺陷型的枯草桿菌DBl04 中進行表達，得到突變的堿性蛋白酶，各種突變酶具有抗氧化和增加穩(wěn)定性的特點，具備了工業(yè)用酶的條件。,,,