《基因工程技術》PPT課件.pptx

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1、 1、 反 轉 錄 PCR(RT-PCR) 2、 反 向 PCR3、 復 合 PCR 4、 不 對 稱 PCR 5、 嵌 套 PCR6、 實 時 定 量 PCR 類 似 于 DNA的 體 內 復 制 。 首 先 待 擴 增 DNA模 板加 熱 變 性 解 鏈 ， 隨 之 將 反 應 混 合 物 冷 卻 至 某一 溫 度 ， 這 一 溫 度 可 使 引 物 與 它 的 靶 序 列 發(fā)生 退 火 ， 再 將 溫 度 升 高 使 退 火 引 物 在 DNA聚 合酶 作 用 下 得 以 延 伸 。 這 種 熱 變 性 -復 性 -延 伸的 過 程 就 是 一 個 PCR循 環(huán) ， PCR就 是 在 合

2、 適 條件 下 的 這 種 循 環(huán) 的 不 斷 重 復 。 模 板 DNA的 變 性 ： 模 板 DNA經(jīng) 加 熱 至 93-95 左 右 一 定 時間 后 ,使 模 板 DNA雙 鏈 或 經(jīng) PCR擴 增 形 成 的 雙 鏈 DNA解 離 ,使之 成 為 單 鏈 ,以 便 它 與 引 物 結 合 ,為 下 輪 反 應 作 準 備 ； 模 板 DNA與 引 物 的 退 火 (復 性 )： 模 板 DNA經(jīng) 加 熱 變 性 成 單 鏈后 ,溫 度 降 至 55 左 右 ,引 物 與 模 板 DNA單 鏈 的 互 補 序 列 配 對結 合 ； 引 物 的 延 伸 ： DNA模 板 -引 物 結 合

3、 物 在 TaqDNA聚 合 酶 的 作 用下 ， 以 dNTP為 反 應 原 料 ， 靶 序 列 為 模 板 ， 按 堿 基 配 對 與 半 保留 復 制 原 理 ， 合 成 一 條 新 的 與 模 板 DNA 鏈 。注 :每 完 成 一 個 循 環(huán) 需 2 4分 鐘 ， 2 3小 時 就 能 將 待 擴 目的 基 因 擴 增 放 大 幾 百 萬 倍 1、 緩 沖 溶 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 劑 2、 耐 熱 DNA聚 合 酶3、 脫 氧 核 糖 三 磷 酸 核 苷 酸 (dNTPs)4、 模 板 DNA5、 上 游 引 物 、 下 游 引 物 （ 1 ） 、 PCR反

4、 應 緩 沖 液 Mg2+是 DNA聚 合 酶 的 激 活 劑 。 1.5mmol/L-2.5mmol/L反 應 體 系 。 Mg2+濃 度 過 低 會 使 Taq酶 活 性 喪 失 、 PCR產(chǎn) 量下 降 ； Mg2+過 高 影 響 反 應 特 異 性 。 Mg2+可 與 負 離 子 結 合 ， 所 以 反 應 體 系 中 dNTP、 EDTA等 的 濃 度 影 響 反 應 中 游 離 的 Mg2+濃 度 。 （ 2） Taq DNA聚 合 酶 （ thermus aquaticus) 0.5-5 U/100L 酶 量 增 加 使 反 應 特 異 性 下 降 ;酶 量 過 少 影 響 反 應

5、 產(chǎn) 量 。（ 3） dNTP dNTP濃 度 取 決 于 擴 增 片 段 的 長 度 四 種 dNTP濃 度 應 相 等 ,一 般 為 50-200mol/L 濃 度 過 高 易 產(chǎn) 生 錯 誤 堿 基 的 摻 入 ， 濃 度 過 低 則 降 低 反 應 產(chǎn) 量 dNTP可 與 Mg 2+結 合 ， 使 游 離 的 Mg2+濃 度 下 降 ， 影 響 DNA聚合 酶 的 活 性 。 （ 4） 模 板 單 、 雙 鏈 DNA均 可 。 不 能 混 有 蛋 白 酶 、 核 酸 酶 、 DNA聚 合 酶 抑 制 劑 、 DNA結 合 蛋 白 類 。 一 般 100ng DNA模 板 /100L。

6、模 板 濃 度 過 高 會 導 致 反 應 的 非 特 異 性 增 加 。（ 5） 引 物 濃 度 0.1-1mol/L 濃 度 過 高 易 導 致 模 板 與 引 物 錯 配 ,反 應 特 異 性 下 降 。 引 物 長 度 一 般 以 15 30bp為 宜 ,過 短 則 降 低 特 異 性 ， 過 長 則 會 引 起 引 物間 退 火 而 影 響 有 效 擴 增 。 避 免 引 物 內 部 出 現(xiàn) 二 級 結 構 ， 避 免 序 列 內 有 較 長 的 回 文 結 構 ， 使 引 物 自身 不 能 形 成 發(fā) 夾 結 構 。 G /C和 A/T堿 基 均 勻 分 布 ， G /C含 量 在

7、 45 55%之 間 ， 引 物 堿 基 序 列 盡可 能 選 擇 堿 基 隨 機 分 布 ， 避 免 出 現(xiàn) 嘌 呤 或 嘧 啶 連 續(xù) 排 列 。 要 避 免 兩 個 引 物 間 特 別 是 3末 端 堿 基 序 列 互 補 以 及 同 一 引 物 自 身 3末 端堿 基 序 列 互 補 的 ， 使 它 們 不 能 形 成 引 物 二 聚 體 或 發(fā) 卡 結 構 。 引 物 3末 端 堿 基 一 般 應 與 模 板 DNA嚴 格 配 對 ， 并 且 3末 端 為 G 、 C或 T時引 發(fā) 效 率 較 高 。 引 物 5末 端 堿 基 可 不 與 模 板 DNA匹 配 ， 可 添 加 與 模

8、 板 無 關 的 序 列 (如 限制 性 核 酸 內 切 酶 的 識 別 序 列 、 ATG 起 始 密 碼 子 或 啟 動 子 序 列 等 )， 便 于 克 隆 和 表 達 ， 但 其 保 護 堿 基 有 一 定 的 要 求 。 引 物 的 堿 基 順 序 不 能 與 非 擴 增 區(qū) 有 同 源 性 。 （ 1） 變 性 使 雙 鏈 DNA解 鏈 為 單 鏈 ,95 3 5分 鐘 (2) 退 火 溫 度 由 引 物 長 度 和 G C含 量 決 定 , 適 宜 的 退 火 溫 度 大 約 低 于 引 物Tm值 45-55 ， 介 于 45-55 。 增 加 溫 度 能 減 少 引 物 與 模

9、 板 的 非 特異 性 結 合 ;降 低 溫 度 可 增 加 反 應 的 靈 敏 性 。（ 3） 延 伸 72 ， 延 伸 時 間 由 擴 增 片 段 長 度 決 定（ 4） 循 環(huán) 次 數(shù) 主 要 取 決 于 模 版 DNA的 濃 度 一 般 為 25-35次 次 數(shù) 過 多 ： 擴 增 效 率 降 低 錯 誤 摻 入 率 增 加 標 準 的 PCR反 應 條 件10 緩 沖 液 10 L4種 dNTP混 合 物 各 200umol/L引 物 各 10 100pmol模 板 DNA 0.1 2gTaq DNA聚 合 酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L （ 一 ） 防 止 污 染試 劑

10、小 量 分 裝吸 頭 及 EP管 一 次 性 使 用器 皿 及 工 作 區(qū) 域 要 分 開 ，無 菌 操 作（ 二 ） 設 立 對 照陽 性 對 照 ： 陽 性 模 板陰 性 對 照 ： 陰 性 模 板試 劑 對 照 ： 除 模 板 外的 所 有 組 分 靈 敏 度 高1.皮 克 (pg=10-12)量 級 擴 增 到 微 克 (ug=10-6)水平2.能 從 100萬 個 細 胞 中 檢 出 一 個 靶 細 胞3.病 毒 檢 測 的 靈 敏 度 可 達 3個 RFU4.細 菌 檢 測 的 最 小 檢 出 率 為 3個 細 菌簡 便 、 快 速1.一 次 性 加 好 反 應 液 ， 2 4 h

11、完 成 擴 增2.擴 增 產(chǎn) 物 一 般 用 電 泳 分 析對 標 本 的 純 度 要 求 低u血 液 、 體 腔 液 、 洗 嗽 液 、 毛 發(fā) 、 細 胞 、 活 組織 等 組 織 的 粗 提 DNA 1. 基 礎 研 究 基 因 或 cDNA 克 隆 ： 從 基 因 數(shù) 據(jù) 庫 中 獲 得 某 一 基 因 或 cDNA 核 苷 酸 序 列 ,用 PCR 方 法 擴 增 并 克 隆 該 基 因 或 cDNA。 基 因 表 達 ： 用 RT-PCR檢 測 某 一 特 定 基 因 在 轉 錄 水 平 的 表 達 。2. 醫(yī) 學 感 染 性 疾 病 病 原 體 的 診 斷 ： H IV、 結 核 桿 菌 、 乙 肝 病 毒 等 。 遺 傳 病 相 關 基 因 檢 測 ： 鐮 刀 型 細 胞 貧 血 、 血 友 病 。 惡 性 腫 瘤 的 診 斷 。3. 法 醫(yī) 學 中 的 基 因 和 親 子 鑒 定4. 考 古 學 中 生 物 種 類 間 的 親 緣 關 系 、 進 化 途 徑 判 定5. 基 因 動 、 植 物 的 檢 測 轉 基 因 動 物 的 檢 測 ： 檢 測 某 一 基 因 的 遺 傳 穩(wěn) 定 性 。 轉 基 因 植 物 的 檢 測 ： 玉 米 、 大 豆 等 。