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1、 考綱要求展示知識(shí)內(nèi)容要求微生物的分離和培養(yǎng)某種微生物數(shù)量的測(cè)定培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用 知識(shí)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 一、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1. 培養(yǎng)基(1)概念：人們按照微生物對(duì)_的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。(2)成分：一般都含有碳源、_、水和_，還需要滿(mǎn)足不同微生物生長(zhǎng)對(duì)_、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及_的要求。2. 無(wú)菌技術(shù)(1)含義：指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有_的方法。(2)關(guān)鍵：防止外來(lái)_的入侵。(3)方法：消毒：_、化學(xué)藥劑消毒法、_。滅菌：_滅菌、干熱滅菌、_滅菌。 3. 實(shí)驗(yàn)操作(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基過(guò)程：計(jì)算、_、溶化、_、倒平板。(2)純化大腸桿菌的原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀
2、釋或分散成_，形成單個(gè)菌落，此菌落是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群體。(3)微生物的常用接種方法：_和稀釋涂布平板法，接種過(guò)程仍然是_操作。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1. 分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是由于它們體內(nèi)能合成_，這種物質(zhì)在把尿素分解成無(wú)機(jī)物的過(guò)程中起到_作用。 2. 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌一般用_。3. 實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣、制備_、微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察、細(xì)菌的計(jì)數(shù)。三、分解纖維素的微生物的分離1. 纖維素酶的組成：一種_，它至少包括三種組分，即C1酶、_酶和_酶。2. 篩選方法：剛果紅染色法，即通過(guò)是否產(chǎn)生_來(lái)篩選纖維素分解菌。3. 實(shí)驗(yàn)操作步驟：土壤取樣、
3、_、_、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上、_。 【自我校對(duì)】一、1. (1)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) (2)氮源 無(wú)機(jī)鹽 pH 氧氣 2. (1)防止雜菌污染 (2)雜菌 (3)煮沸消毒法 紫外線(xiàn)消毒法 灼燒 高壓蒸汽 3. (1)稱(chēng)量 滅菌 (2)單個(gè)細(xì)胞 (3)平板劃線(xiàn)法無(wú)菌二、1. 脲酶 催化 2. 稀釋涂布平板法 3. 培養(yǎng)基三、1. 復(fù)合酶 Cx 葡萄糖苷 2. 透明圈 3. 選擇培養(yǎng) 梯度稀釋 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 微生物的培養(yǎng)一、培養(yǎng)基的類(lèi)型及其應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類(lèi)型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離，鑒定，計(jì)數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少菌種保存液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，
4、連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，成分明確菌種分類(lèi)、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)，降低成本 目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加(或缺少)某種化學(xué)成分菌種的分離 二、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)定義作用主要來(lái)源碳源能提供碳元素的物質(zhì)構(gòu)成生物體的物質(zhì)，異養(yǎng)生物的能源物質(zhì)無(wú)機(jī)物：CO2、NaH CO3有機(jī)物：糖類(lèi)、脂肪酸、石油、花生粉餅等氮源能提供氮元素的物質(zhì)合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代謝產(chǎn)物無(wú)機(jī)物：N 2、NH 3、氨鹽、硝酸鹽有機(jī)物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)不可少的微量有機(jī)物酶和核酸的成分維生素、氨基酸、堿基等 (1)
5、微 生 物 最 常 利 用 的 碳 源 是 糖 類(lèi) (特 別 是 葡 萄 糖 )， 常利 用 的 氮 源 是 氨 鹽 、 硝 酸 鹽 。(2)在 微 生 物 所 需 要 的 化 合 物 中 需 要 量 最 大 的 是 碳 源 。(3)微 生 物 之 所 以 需 要 補(bǔ) 充 生 長(zhǎng) 因 子 ， 是 由 于 缺 乏 合 成這 些 物 質(zhì) 所 需 要 的 酶 或 合 成 能 力 有 限 。 三、無(wú)菌技術(shù)1. 消毒與滅菌的區(qū)別滅菌方法條件結(jié)果常用方法消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法，還有化學(xué)藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線(xiàn)
6、消毒滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢 子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌 2. 實(shí)驗(yàn)室常用滅菌方法的比較滅菌方法適用對(duì)象所需條件滅菌時(shí)間灼燒滅菌接種的金屬工具(如接種針、接種環(huán))在酒精燈的火焰外焰灼燒直至燒紅干熱滅菌耐高溫需干燥的物品(如玻璃器皿、金屬用具)干熱滅菌箱內(nèi)160170 12 h高壓滅菌培養(yǎng)基100 kPa；121 1530 min 1. 芽 孢 是 細(xì) 菌 發(fā) 育 后 期 形 成 的 休 眠 體 ， 耐 高 溫 ， 故 消 毒 僅 殺死 物 體 表 面 或 內(nèi) 部 一 部 分 對(duì) 人 體 有 害 的 微 生 物 而 不 包 括 其 芽孢 和 孢 子 。2.
7、 滅 菌 和 消 毒 的 實(shí) 質(zhì) 大 都 是 使 微 生 物 的 蛋 白 質(zhì) 或 核 酸 發(fā) 生 變性 。3. 微 生 物 分 離 中 的 無(wú) 菌 技 術(shù) ： 獲 得 純 凈 培 養(yǎng) 物 的 關(guān) 鍵 是 防 止雜 菌 污 染 ， 無(wú) 菌 技 術(shù) 可 從 如 下 四 個(gè) 方 面 展 開(kāi) ：(1)對(duì) 實(shí) 驗(yàn) 操 作 的 空 間 ， 操 作 者 的 衣 著 和 手 進(jìn) 行 清 潔 和 消 毒 。(2)將 用 于 微 生 物 培 養(yǎng) 的 器 皿 、 接 種 用 具 和 培 養(yǎng) 基 等 進(jìn) 行 滅 菌 。(3)為 避 免 周 圍 環(huán) 境 中 微 生 物 的 污 染 ， 實(shí) 驗(yàn) 操 作 應(yīng) 在 酒 精 燈
8、 火焰 附 近 進(jìn) 行 。(4)實(shí) 驗(yàn) 操 作 時(shí) ， 應(yīng) 避 免 已 經(jīng) 滅 菌 處 理 的 材 料 用 具 與 周 圍 的 物品 相 接 觸 。 【例1】下列說(shuō)法正確的是()A. 培養(yǎng)基是為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的B. 培養(yǎng)基只有兩類(lèi)，液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基C. 除水以外的無(wú)機(jī)物只能提供無(wú)機(jī)鹽 D. 無(wú)機(jī)氮源不可能提供能量【解析】根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中加入不同量的凝固劑可形成半固體或固體培養(yǎng)基；除水以外的無(wú)機(jī)物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不僅僅能提供無(wú)機(jī)鹽；無(wú)機(jī)氮源有時(shí)也能提供能量，如NH3可以為硝化細(xì)菌提供
9、能量?！敬鸢浮緼 1. 培養(yǎng)基的配制原則目的要明確：根據(jù)微生物的種類(lèi)、培養(yǎng)目的選擇不同的原料配制培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：配制培養(yǎng)基時(shí)要注意各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例、pH要適宜。2. 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。不同培養(yǎng)基還要滿(mǎn)足不同微生物對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。 1. (2011合肥質(zhì)檢)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的下列操作中，不正確的是()A. 操作流程是計(jì)算、稱(chēng)量、溶化、滅菌和倒平板B. 將稱(chēng)好的牛肉膏連同稱(chēng)量紙一同倒入燒杯中再加水，去紙C. 滅菌后向牛肉膏蛋白胨溶液中加2%瓊脂，并使其溶解D. 將培養(yǎng)基冷卻到約50度時(shí)，在酒精燈火焰
10、附近倒平板【解析】牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的操作步驟是計(jì)算、稱(chēng)量、溶化、滅菌、倒平板；將稱(chēng)好的牛肉膏與稱(chēng)量紙一同放在燒杯中，加入少量水，加熱，牛肉膏溶化并與稱(chēng)量紙分離后，用玻璃棒撈出稱(chēng)量紙；滅菌前將蛋白胨和氯化鈉加入燒杯；等培養(yǎng)基冷卻到50度左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板?！敬鸢浮緾 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)原理1. 篩選菌株：常用選擇培養(yǎng)基。2. 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)。3. 設(shè)置對(duì)照。 二、實(shí)驗(yàn)流程1. 土壤取樣：一般在距地表約38 cm的土壤層取樣(富含有機(jī)物、潮濕、pH7)。2. 制備培養(yǎng)基：準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。
11、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。3. 微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察：將土樣以1、101、102依次等比稀釋至107稀釋度，按照濃度從低到高的順序涂布平板。注明培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)日期以及平板培養(yǎng)樣品的稀釋度。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。4. 細(xì)菌的計(jì)數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，進(jìn)行計(jì)數(shù)，防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。求出平均值，根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。 【例2】某同學(xué)在101、102、103倍稀釋液的平均菌落數(shù)為2 760、295和
12、46，則菌落總數(shù)(個(gè)/mL)為()A. 2.76104B. 2.95104C. 4.6104 D. 3.775104【解析】菌 落 計(jì) 數(shù) 法 ， 注 意 是 計(jì) 算 不 同 稀 釋 度 的 平 均 菌 落 數(shù) 。 首先 選 擇 平 均 菌 落 數(shù) 在 30 300之 間 的 ， 當(dāng) 只 有 一 個(gè) 稀 釋 倍 數(shù) 的 平均 菌 落 數(shù) 符 合 此 范 圍 時(shí) ， 則 以 該 平 均 菌 落 乘 以 稀 釋 倍 數(shù) 即 為 該 樣品 的 細(xì) 菌 總 數(shù) ； 若 有 兩 個(gè) 稀 釋 倍 的 平 均 菌 落 數(shù) 均 在 30 300之 間 ，則 按 兩 者 菌 落 總 數(shù) 之 比 值 來(lái) 決 定
13、， 若 比 值 小 于 2應(yīng) 采 取 兩 者 的 平均 數(shù) ， 若 大 于 2， 則 取 其 中 較 小 的 菌 落 總 數(shù) 。 本 題 295、 46在 30300之 間 ， 46103與 29510 2比 值 為 1.6， 應(yīng) 取 二 者 平 均 數(shù)(46103 295102) 2 3.775104。 若 所 有 稀 釋 倍 數(shù) 的 菌 落 數(shù)均 不 在 30 300之 間 ， 則 應(yīng) 以 最 接 近 300或 30的 平 均 菌 落 乘 以 稀 釋倍 數(shù) ?！敬鸢浮緿 微生物計(jì)數(shù)規(guī)則1. 選 擇 菌 落 數(shù) 在 30 300的 平 板 計(jì) 數(shù) 。2. 若 某 兩 個(gè) 或 多 個(gè) 稀 釋
14、濃 度 下 獲 得 的 菌 落 數(shù) 均 符 合 條 件 時(shí) ，再 看 兩 者 菌 落 數(shù) 的 比 值 ， 若 小 于 2， 則 取 兩 者 的 平 均 值 ；若 大 于 2， 則 取 最 小 值 。3. 計(jì) 算 方 法 ： 每 克 樣 品 中 的 菌 落 數(shù) (C/V)M。C： 某 一 稀 釋 度 下 平 板 上 生 長(zhǎng) 的 平 均 菌 落 數(shù) ； V： 涂 布 平板 所 用 稀 釋 液 的 體 積 (mL)； M： 稀 釋 倍 數(shù) 。 2. 用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是()A. 涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是23
15、0B. 涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C. 涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D. 涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233【解析】在 設(shè) 計(jì) 實(shí) 驗(yàn) 時(shí) ， 一 定 要 涂 布 至 少 3個(gè) 平 板 ， 才 能 增 強(qiáng) 實(shí)驗(yàn) 的 說(shuō) 服 力 與 準(zhǔn) 確 性 。 C項(xiàng) 雖 涂 布 了 3個(gè) 平 板 ， 但 是 ， 其 中 1個(gè) 平板 的 計(jì) 數(shù) 結(jié) 果 與 另 兩 個(gè) 相 差 太 遠(yuǎn) ， 說(shuō) 明 在 操 作 過(guò) 程 中 可 能 出 現(xiàn)了 錯(cuò) 誤 ， 因 此 ， 不 能 簡(jiǎn) 單 地 將 3個(gè) 平 板
16、 的 計(jì) 數(shù) 值 用 來(lái) 求 平 均 值 。【答案】D 分解纖維素的微生物的分離一、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)流程土壤取樣選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來(lái)確定)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別 纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。 【例3】纖維素分解菌的篩選原理是()A. 剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物B. 剛果紅可以與水解的纖維二糖和葡萄糖形成紅色復(fù)合物C. 剛果紅可以與纖維素酶形成紅色復(fù)合物D. 剛果紅可以與纖維素分解菌結(jié)合形成紅色復(fù)合物【解析】剛 果 紅 是 一 種 染 料 ， 它 可 以 與 像 纖 維 素 這 樣 的多 糖 物 質(zhì) 形 成 紅 色 復(fù) 合 物 ， 但
17、并 不 和 水 解 后 的 纖 維 二 糖和 葡 萄 糖 發(fā) 生 這 種 反 應(yīng) 。 剛 果 紅 也 不 與 纖 維 素 酶 或 者 與纖 維 素 分 解 菌 結(jié) 合 形 成 紅 色 復(fù) 合 物 。【答案】A 選 擇 培 養(yǎng) 的 目 的 是 增 加 纖 維 素 分 解 菌 的 濃 度 ， 確 保 能夠 從 樣 品 中 分 離 到 所 需 要 的 微 生 物 。涉 及 到 微 生 物 技 術(shù) 主 要 有 ： 培 養(yǎng) 基 的 配 制 、 無(wú) 菌 操 作技 術(shù) 、 稀 釋 涂 布 平 板 法 、 選 擇 培 養(yǎng) 基 的 作 用 、 土 壤 取樣 等 。 3. 分離纖維素分解菌的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作有誤的是()A. 經(jīng)選擇培養(yǎng)后將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上B. 富集培養(yǎng)這一步可省略，但培養(yǎng)纖維素分解菌少C. 經(jīng)稀釋培養(yǎng)后，用剛果紅染色D. 對(duì)照組可用同樣量的培養(yǎng)液涂布到不含纖維素的培養(yǎng)基上【解析】經(jīng) 選 擇 培 養(yǎng) 后 ， 再 經(jīng) 稀 釋 ， 才 能 將 樣 品 涂 布 到 鑒別 纖 維 素 分 解 菌 的 培 養(yǎng) 基 上 ； 富 集 培 養(yǎng) 可 省 略 ； 經(jīng) 稀 釋 培養(yǎng) 后 ， 用 剛 果 紅 染 色 ； 設(shè) 置 對(duì) 照 能 證 明 經(jīng) 富 集 培 養(yǎng) 的 確 得到 了 欲 分 離 的 微 生 物 ?！敬鸢浮緼
微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用學(xué)案 精校版
