發(fā)酵工程 復習整理資料

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1、第一章 緒論 生物技術：有時也稱生物工程，是指以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。 現代生物技術包括：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質工程、生化工程。 “發(fā)酵”定義 1.無氧條件下，底物脫氫后產生的還原力[H]未經呼吸鏈傳遞而直接交給某一內源性中間代謝產物，以實現底物水平磷酸化的一類低效產能生物氧化反應稱為發(fā)酵。 （如酒精發(fā)酵） （微生物生理學上的定義、狹義、無氧） 2.利用微生物的新陳代謝作用，把底物（有機物）轉化成中間產物，從而獲得某種工業(yè)產品。（工

2、業(yè)上定義、廣義、有氧無氧均可） 乙醇發(fā)酵（酵母菌） 原料：糯米等淀粉原料 菌種：酵母 該乙醇發(fā)酵過程在pH3.5~4.5以及厭氧的條件下發(fā)生。 發(fā)酵工程是研究利用微生物發(fā)酵作用為工業(yè)大規(guī)模生產服務的一門工程技術學科。 發(fā)酵工程： 上游工程1.菌種選育2.培養(yǎng)基設計3.滅菌4.接種 發(fā)酵過程控制 溫度、pH、溶解氧、泡沫等 下游工程1.產物提取、純化、分析2.廢棄物處理 發(fā)酵流程 課程學習任務 原料到產品整個過程。 發(fā)酵和提純，發(fā)酵為主。 (1)發(fā)酵部分:菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵機制、發(fā)酵工藝過程控制、發(fā)酵染菌的防治 (2)提純部分：下游技術 學會比

3、擬放大（或稱模型放大）的原理 普遍 小型實驗－中間規(guī)模試驗(中試)－大型規(guī)模生產(工業(yè)化生產) 發(fā)酵工程 斜面菌種－搖瓶試驗(培養(yǎng)基、 溫度、 起始pH值、 需氧量、 發(fā)酵時間)－小型發(fā)酵罐－中試－大規(guī)模工業(yè)生產 l 懂得分析和解決微生物工業(yè)生產中的具體問題，進一步提高發(fā)酵產品的質量和產率。 l 初步具備選育優(yōu)良菌種，合理控制發(fā)酵條件和調節(jié)代謝途徑的能力。 l 使生產過程連續(xù)化、自動化，探求新工藝、新設備和從事微生物工程研究和設計的能力。 發(fā)酵工業(yè)發(fā)展史 1、自然發(fā)酵時期 2、純培養(yǎng)技術建立 (第一個轉折期) 列文.虎克 巴斯德 科赫 布赫納兄弟 3

4、、通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術建立(第二個轉折期) 弗萊明 4、人工誘變育種與代謝控制發(fā)酵工程技術建立 (第三個轉折期) 5、發(fā)酵動力學、連續(xù)化、自動化工程技術的建立(第四個轉折期) 6、生物合成和化學合成相結合工程技術建立(第五個轉折期) 化學工程與發(fā)酵工程 o 本質區(qū)別 化學工程利用非生物催化劑;發(fā)酵工程利用生物催化劑—酶 o 利用微生物進行工業(yè)生產的優(yōu)勢 體積小、面積大，吸收多、轉化快，生長旺、 繁殖快，適應強、易變異，分布廣、種類多 o 微生物工程的難題 (1)發(fā)酵部分:發(fā)酵醪(發(fā)酵醅、發(fā)酵液)不服從牛頓力學規(guī)律 (2)提純部分:需采取一些特殊的工藝措

5、施并選用合適的設備 發(fā)酵工業(yè)發(fā)展趨勢 1、幾個轉變 l 分解代謝→合成代謝 l 自然發(fā)酵→人工控制的突變型發(fā)酵→代謝控制發(fā)酵→通過遺傳因子的人工支配建立的發(fā)酵（如工程菌） 2、化學合成與生物合成相結合 3、大型、連續(xù)化、自動化發(fā)酵 發(fā)酵罐的容量可達500t，常用的也達20-30t。 4、人工誘變育種和代謝控制發(fā)酵 微生物潛力進一步挖掘，新菌株、新產品層出不窮。 5、原料范圍不斷擴大 石油、植物淀粉、天然氣、空氣、纖維素、木質素等 發(fā)酵工業(yè)范圍 2 釀酒工業(yè)（啤酒、葡萄酒、白酒） 食品工業(yè)（醬、醬油、食醋、腐乳、面包、酸乳） 2

6、 有機溶劑發(fā)酵工業(yè)（酒精、丙酮、丁醇） 抗生素發(fā)酵工業(yè)（青霉素、鏈霉素、土霉素等） 2 有機酸發(fā)酵工業(yè)（檸檬酸、葡萄糖酸等） 酶制劑發(fā)酵工業(yè)（淀粉酶、蛋白酶等） 2 氨基酸發(fā)酵工業(yè)（谷氨酸、賴氨酸等） 核苷酸類物質發(fā)酵工業(yè)（肌苷酸、肌苷等） 2 維生素發(fā)酵工業(yè)（維生素B12、維生素B2等）生理活性物質發(fā)酵工業(yè)（激素、赤霉素等） 2 名貴醫(yī)藥產品發(fā)酵工業(yè)（干擾素、白介素等）微生物菌體蛋白發(fā)酵工業(yè)（酵母、單細胞蛋白） 2 微生物環(huán)境凈化工業(yè)（利用微生物處理廢水等） 2 生物能源工業(yè)（沼氣、纖維素等天然原料發(fā)酵生產酒精、乙烯等能源物質） 2 微生物治金工業(yè)（微生物

7、探礦、治金、石油脫硫等） 第二章 發(fā)酵基礎知識 發(fā)酵產品類型 微生物菌體 1. 單細胞蛋白 （飼料添加劑、食品） 生產用原料：糖蜜、紙漿廢液、谷氨酸發(fā)酵廢液、稻草、稻殼、玉米芯、木屑等的水解液；天然氣、乙醇、乙烷等；乳制品和啤酒生產的廢棄物。 發(fā)酵方法：深層通氣發(fā)酵和固體通風發(fā)酵。 主要用途：單細胞食品；食品添加劑、飼料添加劑；提取核苷酸、輔酶A、乳糖酶等醫(yī)藥及生物試劑 主要菌種：產朊假絲酵母、解脂假絲酵母、嗜石油假絲酵母等 2.食（藥）用菌 （蘑菇、香菇、靈芝、猴頭等） 3.微生物農藥（細菌、真菌、病毒：蘇云金桿菌、白僵菌） 4.疫苗（細菌、病毒） 第

8、一代：病原微生物及其產物 第二代：基因工程疫苗 第三代：人工合成疫苗 5.微生態(tài)制劑（細菌：乳酸菌、雙歧桿菌） 代謝產物 （分為初級代謝產物、次級代謝產物，這是一類當前最主要的微生物發(fā)酵產品，也是開發(fā)潛力最大的一類）；酒精、醬油、食醋、酸奶、谷氨酸、檸檬酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素、抗生素、毒素、激素、色素等 酶 酶制劑工業(yè)是利用微生物發(fā)酵，獲得與生物體內的酶具有相同功能的酶制劑。 近幾年，酶制劑的生產和應用研究已普遍引起各國的重視，已在食品、發(fā)酵、紡織、醫(yī)藥、造紙、皮革、化工、石油、畜牧飼料等部門得到應用。我國主要應用在食品方面，其中產量較大的是α-淀粉酶、糖化酶、葡萄

9、糖異構酶、蛋白酶和脂肪酶。 發(fā)酵菌種 微生物菌體 1.單細胞蛋白：酵母、霉菌、細菌、藻類 2.食（藥）用菌：大型真菌 3.微生物農藥：細菌、真菌、病毒 4.疫苗：細菌、病毒 5.微生態(tài)制劑：細菌 代謝產物 1、酒精飲料 啤酒：啤酒酵母 葡萄酒：酵母菌 黃酒：霉菌（根霉、曲霉）、酵母菌、細菌 白酒：同黃酒 2、調味品 豆腐乳：霉菌（根霉、毛霉、曲霉） 醬油：米曲霉、酵母菌屬、片球菌屬 食醋：霉菌、酵母菌、醋酸菌 味精（谷氨酸鈉）：谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌 檸檬酸：黑曲霉 火

10、腿：曲霉、青霉 酸泡菜：腸膜狀明串球菌、植物乳桿菌 3、發(fā)酵乳制品 酸奶：乳酸菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌） 干酪：乳酸菌、青霉、丙酸菌等 4、抗生素：放線菌、霉菌、細菌 5、面包：啤酒酵母 酶 主要是霉菌，其次是酵母菌和細菌 發(fā)酵三要素 原料 傳統(tǒng)工藝：原料選擇菌種（為什么？） 發(fā)酵原料是一種選擇培養(yǎng)基。 傳統(tǒng)工藝就是利用這種選擇作用，把自然界帶入的各種野生菌，在發(fā)酵基質上進行選擇富集培養(yǎng)，這些微生物生長和代謝的結果可生產出有特殊風味的食品。 菌種 現代工藝：菌種選擇原料（為什么？） 在使用純種發(fā)酵劑前，我們必須對原料進行滅

11、菌，以防止其他雜菌對發(fā)酵的干擾。 工藝條件 以適合菌種生長、繁殖與合成所需產物為依據，選擇合適的溫度、pH值、溶解氧、泡沫、氧化還原電位等。 根據涉及到的微生物種類 1、單菌發(fā)酵 現代發(fā)酵工業(yè)中最常見，傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中很難實現。 2、混合菌發(fā)酵 自然發(fā)酵 人工接種發(fā)酵 根據基質物理狀態(tài) 1、液態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質呈流動狀態(tài)，如啤酒發(fā)酵、檸檬酸發(fā)酵等。 2、半固態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質呈半流動狀態(tài)，如黃酒發(fā)酵、傳統(tǒng)稀醪醬油發(fā)酵等。 3、固態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵基質呈不流動狀態(tài)。如固態(tài)醬油發(fā)酵、米醋發(fā)酵、大曲酒（白

12、酒）發(fā)酵等。 發(fā)酵工藝流程 菌種篩選 菌種純化 搖瓶試驗 小型發(fā)酵罐試驗 種子罐擴大培養(yǎng) 發(fā)酵罐工廠化生產 發(fā)酵產物形成過程 （第一階段） （第二階段） （第三階段） （原料預處理）（主發(fā)酵） （主、后發(fā)酵） （后發(fā)酵） 發(fā)酵產品的附加值 一、發(fā)酵有利于食品保藏 食品發(fā)酵后，改變了食品的滲透壓、酸度、水的活性等，從而抑制了腐敗微生物的生長，有利于食品保藏。 二、發(fā)酵產品的保健作用 有些食品經過微生物

13、發(fā)酵后，不僅能產生酸類和醇類等，還能產生某些抗菌素可抑制致病菌和腸內腐敗菌。有些發(fā)酵食品還具有預防心腦血管疾病、整腸、改善便秘、降低膽固醇、增加免疫功能和抗癌等功能。 三、發(fā)酵增加了食品的營養(yǎng)價值 發(fā)酵食品一般比未經發(fā)酵的原食品更富營養(yǎng)。一方面，發(fā)酵通過微生物對營養(yǎng)物質的降解作用，有利于營養(yǎng)物質的消化吸收。另一方面，食品經過發(fā)酵后可以提高某些營養(yǎng)組分如蛋白質的含量，并提高其吸收率，甚至通過微生物的發(fā)酵作用，還可以產生一些維生素。 第三章 微生物工業(yè)菌種的選育與擴大培養(yǎng) 微生物工業(yè)發(fā)酵的基本過程 發(fā)酵原料（玉米、米、薯干、植物、木材、石油等） 菌種

14、 ↓ ↓ 預處理（初選、除雜、粉碎、水解等加工） 選育 ↓ ↓ 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（添加水、無機鹽及其他營養(yǎng)物，調節(jié)碳氮比、pH值等） 活化（斜面） ↓ ↓ 滅菌 擴大培養(yǎng)（搖瓶或 ↓ ↓ 茄子瓶） 接種

15、 發(fā) ↓ ↓ 酵 進一步擴大培養(yǎng) →→→→→大型發(fā)酵（測量和控制發(fā)酵溫度、pH值、 （種子罐） ↓ 溶解氧等） 產物與細胞的分離（過濾、離心、沉淀等） ↓ 產物的精制（離子交換、層析、結晶、干燥等） 提

16、 ↓ 純 產品 菌種發(fā)展總趨勢，如何理解 發(fā)酵菌 氧化菌 野生菌 變異菌 自然選育 代謝控制育種 誘變育種 基因重組定向育種 選擇原則 生長能力強、對原料要求低、原料轉化率高； 選擇抗噬菌體能力強的菌株； 菌種純，不易變異退化； 菌種不是病原菌，不產生任何有害物質； 發(fā)酵副產物少，產

17、物容易分離； 選擇單產高的營養(yǎng)缺陷型突變株、調節(jié)突變株或野生菌株 生產蘇氨酸菌株轉變成生產賴氨酸：高絲氨酸缺陷型 高絲氨酸缺陷型菌株由于缺乏高絲氨酸脫氫酶，不能合成蘇氨酸，從而走另一代謝途徑，使賴氨酸大量積累。 四大類微生物:細菌、酵母菌、霉菌和放線菌都可以用來生產工業(yè)產品。(見P7-8表1-1) 工業(yè)菌種選育 l 菌種來源 根據資料直接向有關科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；通過菌種選育獲得新的微生物菌種。 l 菌種選育定義 按照生產要求，根據微生物遺傳變異理論，利用自然菌種篩選、人工誘變育種、代謝控制育種或基因重組定向育種等方

18、法得到優(yōu)良菌種的工作。 l 目的 理論上:人為地使某種產物過量積累，把生物合成的代謝途徑朝著人們所希望的方向引導，或者促使細胞內發(fā)生基因重組優(yōu)化遺傳性狀，實現人為控制微生物。 工業(yè)上:提高產量、改進質量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用而改善菌種的特性。 4、方法 (1)自然選育 定義從自然界土壤、水、空氣、動物、植物、礦物等樣品中分離篩選得到菌種的方法。 圖 紙片培養(yǎng)顯色法 飽浸含某種指示劑的濾紙片變色圈（如淀粉降解菌篩選） 變色圈法 指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液（如淀粉降解菌篩選）

19、透明圈法 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質形成透明圈(如磷細菌篩選） 生長圈法 利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長（如營養(yǎng)缺陷型微生物為工具菌） 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制工具菌生長的物質（如抗生素產生菌篩選） (2)生產育種 長期生產過程中自然突變獲得優(yōu)良菌株。 (3)抗噬菌體菌株的選育（如去除吸附位點） (4)誘變育種 采用物理、化學誘變因素處理微生物細胞，提高基因的

20、隨機突變幾率，然后通過定向篩選獲得所需優(yōu)良菌株。 圖 (5) 代謝控制育種 通過改變微生物菌種的代謝途徑或代謝自動調節(jié)系統(tǒng)（如增加特定基因拷貝數來提高限速酶含量）而使微生物發(fā)生異常代謝，使所需中間代謝產物過量積累。 6) 基因重組定向育種 通過轉化、轉導、雜交和原生質體融合等遺傳學方法和技術定向地重組微生物DNA，使微生物的功能發(fā)生定向的改變。 基因重組定向育種先進技術能取代傳統(tǒng)育種方法嗎？ 先進育種技術需在優(yōu)良原始菌種基礎上應用才有效。 基因重組

21、產品主要還是一些較短的多肽和小分子蛋白質。 蛋白質類以外的很多發(fā)酵產物（如糖類、有機酸及次級代謝產物等）產生往往受到多個基因的控制，尤其是還有許多發(fā)酵產物的代謝途徑還沒有被確證。 菌種衰退的概念 指菌種整體在多次接種傳代過程中逐漸造成生產能力降低，表現為發(fā)酵力（如對培養(yǎng)基的利用）或繁殖力（如孢子的產生）下降或發(fā)酵產物得率降低的現象。 菌種衰退的常見現象 1.菌落和細胞形態(tài)的改變 2.生長速度緩慢，產孢子越來越少 3.抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等 4.代謝產物生產能力或其對宿主寄生能力下降 菌種衰退產生的原因 1.保藏不恰當 2.傳代次數過多 3.發(fā)生回復

22、突變 4.培養(yǎng)條件不適合 防止菌種衰退的方法 1.作好菌種保藏工作 2.盡可能使每次培養(yǎng)條件適合而一致 3.盡量減少傳代次數 4.應使用幼齡菌培養(yǎng) 菌種的復壯概念 狹義：在菌種已衰退情況下，通過純種分離和生產性能測定等方法，從衰退群體中找出少數未衰退的個體，以恢復原有典型性狀的措施。 廣義：在菌種未衰退前經常有意識地進行純種分離和生產性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個體。 衰退菌種復壯的方法 l 單細胞菌株分離法 l 沸水篩選法 菌液用沸水處理后進行單細胞菌株分離，從而挑選出優(yōu)良菌體。 l 改變培養(yǎng)條件法 采用有利于高產菌株而

23、不利于低產菌株的條件來選出高產菌株。 l 通過宿主體復壯 如Bacillus thuringiensis的復壯 l 誘變處理法 對發(fā)生回復突變進行重新誘變育種。 工業(yè)菌種的保藏 1.原理 根據菌種的生理、生化特點，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)(最好是休眠狀態(tài))。 2.原則 挑選優(yōu)良純種，最好是休眠體（如孢子、芽孢等），創(chuàng)造一個最有利于休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、缺氧、營養(yǎng)物質缺乏等），就可以達到菌種保藏的目的。同時，作為可行的方法，還要考慮方法的經濟和簡便。 3.方法 u 斜面低溫保藏法 菌種在斜面

24、培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長旺盛后存放在4-8℃的冰箱中，一般半年要移植一次。適合保藏實驗室常用菌種。 u 低溫冰箱保藏法 菌種經液體培養(yǎng)后，加入無菌甘油，使甘油含量為30-40%，置于-80℃低溫冰箱中保存，保存期為1-10年。適用于保存各類微生物菌體。 u 石蠟油封保藏法 醫(yī)用石蠟油滅菌冷卻后加在斜面菌種上,超過斜面頂部1cm，在室溫下或冰箱里可保存1-10年。幾乎所有微生物都適用。 u 砂土保藏法 將干的孢子、芽孢與徹底滅菌的砂土混合后裝入砂土管，放入裝有吸濕劑的干燥器或大試管中，加橡皮塞用蠟封嚴，置陰涼干燥處或冰箱中可保藏1-10年。適合于孢子、芽孢等的保存。 u

25、 硅膠保藏法 以純凈硅膠代替砂土,其他與砂土保藏法一樣。 u 冷凍干燥保藏法 瓶中加入菌體或孢子懸液，-40℃低溫冰箱冷凍1h，室溫真空干燥固封，可保存10-數10年。適用于保存各類微生物菌體。保存運輸方便。 u 液氮超低溫保藏法 菌種密封于安踣瓶中, 慢速凍結器中以每分鐘下降1℃的速度下降到-35℃，再迅速降溫至-196℃，并在該溫度下的液氮超低溫罐中保存，保存期為3-9年。適用于保存各類微生物菌體。 微生物工業(yè)種子擴大培養(yǎng) 目的與任務 獲得活力旺盛的、接種數量足夠、純而壯的培養(yǎng)物。 種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)

26、的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數量和質量的純種過程。 工藝 斜面 搖瓶 種子罐 發(fā)酵罐 級數的確定 斜面菌種→一級種子搖瓶培養(yǎng)→二級種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐 （二級） 斜面菌種→一級種子搖瓶培養(yǎng)→二級種子罐培養(yǎng)→三級種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐 （三級）盡量采用二級發(fā)酵 培養(yǎng)類型 1、靜置培養(yǎng)法（嫌氣性發(fā)酵）在發(fā)酵槽等裝置中不通空氣進行發(fā)酵。如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等的發(fā)酵。 2、通氣培養(yǎng)法 （1）液體培養(yǎng)法 （2）固體培養(yǎng)法 谷氨酸生產的種子制備 斜面菌種 一級種子（搖瓶）

27、 二級種子(種子罐) 發(fā)酵 1、斜面菌種 培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5，瓊脂 2%， pH 7.0-7.2 培養(yǎng)條件：32℃，18-24h 培養(yǎng)基特點：營養(yǎng)豐富，原料比較精細。 菌種要求： 生長良好，連續(xù)傳代不超過3次。 ？ 2. 一級種子（搖瓶） 培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%，K2HPO4 0.1% 培養(yǎng)條件：1000ml三角瓶裝液200ml,32℃培養(yǎng)12h。 培養(yǎng)基特點：營養(yǎng)較豐富，原料比斜面培養(yǎng)基粗放。 ？ 3.二級種子(種子罐) 培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5% 培養(yǎng)條件：種子罐（容

28、積為發(fā)酵罐的1%），32℃，7-10h 培養(yǎng)基的特點：營養(yǎng)較豐富，原料更粗放，接近發(fā)酵培養(yǎng)基 種子的質量要求： 1.無雜菌 2.108-109個/ml 3.大小均勻，呈單個或八字排列 4.PH 7.0-7.2時結束 5.活力旺盛 第四章 發(fā)酵培養(yǎng)基的設計 培養(yǎng)基種類 按成分不同劃分 (一) 天然培養(yǎng)基 由天然物質配制、成分不清楚、不穩(wěn)定 麥芽汁培養(yǎng)基 (二) 半組合培養(yǎng)基 主要由天然物質組成，加有某些化學試劑，最常用 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA） (三) 組合培養(yǎng)基 由化學試劑配制、成

29、分精確、穩(wěn)定 高氏1號、查氏培養(yǎng)基 按物理狀態(tài)不同劃分 a) 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基加入1.5-2.0%瓊脂，成為固體狀態(tài)(或大米、麩皮等組成） 常用來進行菌種分離、鑒定、保藏和活菌計數等 b) 半固體培養(yǎng)基 瓊脂含量一般為0.5% 觀察微生物運動、菌種保藏，厭氧菌培養(yǎng)、分離、計數 c) 液體培養(yǎng)基 不加任何凝固劑 大規(guī)模工業(yè)生產、實驗室微生物基礎理論和應用研究 d) 脫水培養(yǎng)基 含有除水外一切成分的干燥培養(yǎng)基 按功能不同劃分 A) 選擇培養(yǎng)基 加入特殊營養(yǎng)物，有利于所需微生物

30、生長或抑制不需要微生物的培養(yǎng)基 加富性、抑制性選擇培養(yǎng)基 用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來 1.在缺乏氮源的培養(yǎng)基上大部分微生物無法生長；2.在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細菌和放線菌 3.在培養(yǎng)基中加入10％酚可以抑制細菌和霉菌。 B) 鑒別培養(yǎng)基 加有能與目的菌無色代謝產物發(fā)生顯色反應的指示劑，只需用肉眼辨別顏色就能從近似菌落中找出目的菌 伊紅美蘭乳糖培養(yǎng)基（EMB） 按培養(yǎng)目的不同劃分 1. 種子培養(yǎng)基 為種子擴大培養(yǎng)設計的培養(yǎng)基，營養(yǎng)較豐富，氮源比例較高。與發(fā)酵培養(yǎng)基接近。 2. 孢子培養(yǎng)基 用于孢子萌發(fā)，營養(yǎng)充足，容易吸收利用，抑制

31、因子在許可范圍內（如辛酸） 3. 發(fā)酵培養(yǎng)基 用于發(fā)酵工業(yè)，碳源含量較高。價廉易得，有利于下游的分離提取。 發(fā)酵培養(yǎng)基的設計 設計目標 營養(yǎng)豐富而完備 PH適當而穩(wěn)定 發(fā)酵單位高 成本、單耗低 周期短 產品質量高 設計原則 明確目的 是實驗室用還是工業(yè)大生產用，是種子擴大培養(yǎng)還是生產發(fā)酵產物？要求獲得菌體還是積累代謝產物，是正常代謝產物還是異常代謝產物，是為異養(yǎng)菌設計的還是為自養(yǎng)菌設計的？ “投其所好” 用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應豐富，氮源含量較高；用于生產代謝產物的發(fā)酵培養(yǎng)

32、基氮源一般應比種子培養(yǎng)基低，若代謝產物是次級代謝產物，要考慮是否加入特殊物質；工業(yè)生產發(fā)酵培養(yǎng)基，應選擇來源廣泛、價格低廉的原料。 設計基本步驟 調查研究 菌種來源、生理特性、生物合成途徑,產物化學性質、提煉方法、質量要求等，以便“投其所好”。 培養(yǎng)基成分的確定 C/N比、重要金屬非金屬等、復合培養(yǎng)試驗 發(fā)酵條件的確定 溫度、起始pH值、溶解氧、氧化還原電位、滲透壓等 查閱文獻，借鑒經驗，借助單因子試驗與復合因子試驗（如正交試驗法）等對培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件進行優(yōu)化。 補料 對碳及氮的代謝予以適當控制，或添加各種養(yǎng)料和前體物質

33、。 不斷完善 在生產實踐過程中不斷調整改進。 發(fā)酵原料轉換及意義 節(jié)約用糧或以其它原材料代替糧食是當前微生物發(fā)酵工業(yè)值得研究的主要課題。 一方面可以從抓發(fā)酵的穩(wěn)定和高產來節(jié)糧。另一個不可忽視的方面是原料的轉換，開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、野生植物纖維、木屑水解物、石油原料與產品（如石蠟、醋酸、乙醇等）、空氣原料（碳酸氣） 前體物質是指在有些氨基酸、核苷酸、抗生素等發(fā)酵中添加一些特殊物質能獲得較高的產率，它們在發(fā)酵中主要起避免反饋抑制、作為產物的前身等作用的特殊物質。 使用原則 加入應適量；可采用間歇分批添加或連續(xù)滴加的方法加入

34、 P34 表2-15 促進劑是指在氨基酸、抗生素和酶制劑發(fā)酵過程中，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中加進某些對發(fā)酵起一定促進作用的物質。 酶制劑生產 加入某些誘導物、表面活性劑及其它一些產酶促進劑，可以大大增加菌體的產酶量。 原理 啟動微生物體內的產酶機構。 改進了細胞的滲透性，同時增強了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧的有效利用。 抗生素生產中加入促進劑促進抗生素生物合成 原理 Z 起生長因素作用 ； 推遲菌體自溶 Z 抑制了某些合成其它產物途徑而使之向所需產物途徑轉化；降低了產生菌的呼吸 Z

35、改變發(fā)酵液的物理性質，改善通氣效果 ； 與產物結合，防止反饋抑制 抗生素是一類由放線菌、細菌、霉菌等微生物產生的次生代謝產物，其微量就可以抑制其他微生物（包括病原菌、病毒）的生長、發(fā)育與代謝，有些能抑制癌細胞的生長和發(fā)育。 抗生素的用途 E 治療人類各種病癥(如肺結核) ；用于飼料工業(yè)的添加劑(注意用量) E 食品工業(yè)的冷藏、冷凍的保存劑 ；防治農作物病蟲草 （農用抗生素） 菌種 放線菌、細菌、霉菌 (以放線菌為主) 抗生素提純 菌絲趨于衰老，有自溶現象出現時,需及時放罐提取。大多數抗生素是從濾液中提取的。 提取方法: 1. 吸附法

36、 利用活性炭、氧化鋁等吸附劑吸附發(fā)酵液中的抗生素，再以適宜的pH值和洗脫劑洗脫，以達到濃縮和提純目的。此法選擇性不高，獲得產品純度較低。 2. 溶媒萃取法 利用抗生素在不同的pH值下在水或有機溶劑中的溶解度不同，反復提取以達到濃縮和提純的目的。 3. 離子交換法 利用某些抗生素鹽類可解離為陽離子和陰離子，經離子交換樹脂達到提純和濃縮的目的。 此法的優(yōu)點是成本較低，產品純度較高，在生產上較為經濟和安全。 4. 沉淀法 利用某些抗生素和酸堿或金屬鹽類，形成不溶性或溶解度極小的復鹽，使抗生素從發(fā)酵液中沉淀析出，然后進一步精制 。 新抗生素生產工業(yè)化的途徑 1.抗

37、生素生產菌株的分離及篩選 大部分抗生素生產菌是從土壤中分離的，特別是富含有機氮的土壤，所以常用肥沃的菜園或森林等處的土壤作為分離抗生素生產菌的來源,進行分離和篩選。 2.抗生性藥理試驗 分離的某一菌株可 使 用檢定菌(如:病理性葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、真菌等)確證是否能生產抗生素物質。常用方法有： （1）交叉劃線試驗法 將被檢菌以帶狀涂抹在瓊脂平板(1條）上，置于27～30℃環(huán)境下培養(yǎng)3d后，以直角交叉狀劃線接種數種檢定菌測定阻止帶的長度，可知道被檢菌對各種檢定菌的抗菌能力。 比較適用于不產生菌絲的被檢菌，如細菌。（為什么

38、？） （2）打點法 先將檢定菌涂布培養(yǎng)在適當的平板培養(yǎng)基上，使其長滿這個平板，將被檢菌以打點的方式接種于檢定菌的平板上培養(yǎng)，以比較阻止圓的直徑大小可得知被檢菌對檢定菌的抗菌能力。 適用于被檢菌是任何菌種。 3.生成新抗生素的確證 生成的抗生素到底是新產品還是已知的，就需對其進行一系列的試驗，連續(xù)測定并記載此抗生素對各種檢定菌的生長阻止情況，然后對照抗菌性帶表，即可確定該抗生素的種類或為新品種。 4.工業(yè)化階段 如果發(fā)現了新的抗生素，還應該檢測它對動物的毒性。如果得到了良好的臨床應用試驗結果，就可開始探討工業(yè)生產的發(fā)酵條件，順序為振蕩培養(yǎng)

39、、小型發(fā)酵槽、試驗工廠等。包括確立培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)條件的選擇和精制設計等等。同時在生產過程中應不斷注意菌株的改良問題。 第五章 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 淀粉水解糖是指在工業(yè)生產上將淀粉水解為以葡萄糖為主的水解液的過程稱為淀粉水解糖的制備，制得的水解液。（淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖） 在工業(yè)生產上將淀粉水解為葡萄糖的過程稱為淀粉的糖化。（廣義） 淀粉水解糖的制備方法與優(yōu)缺點 1、酸解法 又稱酸糖化法，它是以酸（無機酸或有機酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法。 工藝流程：20%淀粉乳 →加酸 →水解 →中和→過濾→活性碳脫色→過濾→淀粉水解糖 優(yōu)點：

40、 缺點 （1）水解時間短 （1）副反應多，產物純度低 （2）所需設備少 （2）需耐腐蝕、高溫、高壓設備 增加了危險性與污染 （3）生產能力大 （3）對淀粉原料要求高：顆粒小而均勻，淀粉乳濃度較低 原料較精細 2、酶解法（雙酶水解法） 酶解法是指用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖，可分兩步， 液化：利用a-淀粉酶將淀粉液化轉化為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加的過程； 糖化：利用糖化酶將糊精或低聚糖進一步水解，轉變?yōu)槠咸烟堑倪^程 （狹義） 優(yōu)點：

41、 缺點 （1）副反應少，產物純度高，質量好且出糖率高 （1）水解時間長 （2）條件溫和，生產安全，污染少 （2）易造成過濾困難、泡沫多等問題 （3）對淀粉原料要求較低；可用粗原料；淀粉乳濃度較高 3、酸酶結合法 集中酸法與酶法優(yōu)點、克服兩者缺點的方法，可分為： 酸酶法 酶酸法 適用于：顆粒堅硬原料 顆粒不均勻、雜質較多原料 不適用于： 正好相反 缺點：設備較多、工藝較復雜 制備方法選擇： l 從水解糖液的質量和降

42、低糖耗、提高原料利用率來說，選擇酶法； l 從水解速度來說，選擇酸法 ； l 綜合考慮各方面因素，選擇酸酶結合法，尤其是酶酸法 。 糖蜜是甘蔗或甜菜制糖的副產物。發(fā)酵前對糖蜜進行稀釋、酸化、滅菌及澄清等過程稱為糖蜜前處理。 種類：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。主要區(qū)別： ①甜菜中蔗糖較多，而轉化糖含量極少，但總糖量接近。 ②甘蔗糖蜜呈微酸性，而甜菜糖蜜則呈微堿性。③甜菜糖蜜中總氮量較豐富。 糖蜜作為發(fā)酵原料的適用性： 含糖量很高；主要含非結晶糖，回收困難；含大量的可發(fā)酵性糖，無需糖化。 糖蜜前處理的方法 1、加酸通風沉淀法 稀釋→酸化→ 通風→澄

43、清 2、加熱加酸沉淀法 加熱稀釋→酸化→ 澄清→稀釋 3、添加絮凝劑澄清處理法 稀釋→酸化→加熱→加絮凝劑→澄清 谷氨酸發(fā)酵的糖蜜預處理 特殊性：生物素限量 原理： Z 產物谷氨酸積累到一定量會形成反饋抑制。需提高細胞膜的滲透性，使胞內的產生的谷氨酸迅速滲漏出去。 Z 細胞膜由磷脂雙分子層和蛋白質組成，磷脂雙分子層由脂肪酸、甘油、磷酸和側鏈組成。 Z 把生物素控制在亞適量，才能生產出大量的谷氨酸。因為生物素是脂肪酸生物合成中乙酰-CoA羧化酶的輔基。 谷氨酸發(fā)酵的糖蜜

44、預處理的方法和各自原理 1糖蜜預處理方法 除去過量生物素 ①活性炭處理法 稀釋，漂白粉，活性炭，過濾 原理：吸附 ②樹脂處理法 原理：吸附 ③亞硝酸處理法 原理：破壞生物素 2.添加化學藥劑處理法 原理：增加細胞膜對谷氨酸的滲透性 ①添加青霉素法 ②添加表面活性劑 ③添加抗氧劑法 3.追加糖蜜法 原理：當谷氨酸酶系統(tǒng)成熟時過量生物素不影響發(fā)酵，可在此時添加未處理的糖蜜進去繼續(xù)正常生產。 4.采

45、用營養(yǎng)缺陷變異株 原理：誘變生物素缺陷型菌株為油酸缺陷型等，是生物素不再影響谷氨酸的積累 纖維素代糧發(fā)酵背景 隨著發(fā)酵工業(yè)的日益擴大，原料短缺問題越來越突出，迫切需要開辟新的原料途徑。 纖維素是自然界最豐富的可再生資源，開發(fā)纖維素代糧發(fā)酵具有非常廣闊的前景。 現狀： 纖維素的基本組成單位是葡萄糖，理論上來說，它是代替糧食的理想發(fā)酵原料。 纖維素很難降解，特別是徹底降解成葡萄糖，所以降解成本較高。 纖維素降解目前主要方法： 蒸汽爆破，時間短，化學品用量少，能耗低 利用纖維素酶水解。 構建基因工程菌，可直接利用纖維素進行發(fā)酵。

46、 分解纖維素的微生物 好氧細菌——粘細菌、鐮狀纖維菌和纖維弧菌 厭氧細菌——產纖維二糖芽孢梭菌、無芽孢厭氧分解菌及嗜熱纖維芽孢梭菌。 放線菌——鏈霉菌屬。 真菌——青霉菌、曲霉、鐮刀霉、木霉及毛霉 第六章 糖嫌氣性發(fā)酵產物積累機制 發(fā)酵機制定義 指微生物通過其代謝活動，利用基質合成人們所需要的產物的內在規(guī)律。 正常產物：合適環(huán)境條件，酒精、乳酸等 異常產物：代謝控制，檸檬酸、谷氨酸等 代謝控制發(fā)酵是指人為地改變微生物的代謝調控機制，使有用中間代謝產物過量積累的發(fā)酵。 1、生物合成途徑 2、代謝調節(jié)機制 環(huán)境因

47、素對代謝方向的影響 改變微生物代謝方向的措施 糖酵解途徑（EMP途徑）和巴斯德效應的三個關鍵酶均是是己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。 丙酮酸的去路 （P50 圖3-2） ① 乙醇發(fā)酵（酵母） ② 乳酸發(fā)酵（乳酸菌） ③丙酸發(fā)酵（丙酸菌） ④ 2,3—丁二醇發(fā)酵 （產氣桿菌） ⑤混合酸發(fā)酵（大腸桿菌） 糖酵解的調節(jié)機制 1.能荷調節(jié)（主要） ATP抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，使酵解減少，當需能反應加強，ATP分解為ADP和AMP，ADP、AMP增加、ATP的抑制作用被解除，同時ADP、AMP激活已糖激酶和磷酸果糖激酶，使6-磷酸葡萄糖、 1，

48、6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等增加，激活丙酮酸激酶，加快酵解。 2.物質調節(jié)（次要） 無機磷解除6-磷酸葡萄糖對己糖激酶的抑制作用。 檸檬酸抑制磷酸果糖激酶。 啤酒概述 酒精度 ：2%-5%，我國為0.5%-3.5%，目前趨勢是往淡爽型發(fā)展 優(yōu)點：營養(yǎng)豐富、風味獨特、含酒精低、容易吸收 啤酒種類 鮮啤酒：未經巴氏滅菌或超濾即出售。新鮮、爽口，保質期短。 生啤酒：未經巴氏滅菌，但經超濾等進行無菌過濾后出售。新鮮、爽口，保質期較短。 熟啤酒：經巴氏滅菌后出售?？辔对黾?，有熟味，保質期長。 生產工藝 水， 酒之血：麥芽，酒之肉（骨）；酒花，酒之眼；菌

49、種，酒之魂。 1)原料 主要原料 水 大麥（麥芽）：以發(fā)芽力強，淀粉含量高，且蛋白質 含量少為好。 大麥先發(fā)芽以合成各種酶（包括淀粉酶、麥芽糖酶、蛋白酶等），以供制備麥芽汁（糖化）的催化劑。 輔助原料 大米、玉米：以淀粉含量高的新鮮糯米為好。可提高出酒率，降低成本。 啤酒花：一種蔓藤性植物的未受精的雌花。啤酒花的作用： 1.酒花油與苦味酸賦予啤酒獨特的香味和爽口的苦味；2.酒花樹脂可提高啤酒泡沫持久性； 3.沉淀蛋白質，有利于啤酒澄清；4.抑菌防腐。 α-淀粉酶：降低生產成本，提高出酒率，改善啤酒風味和色澤。 2)菌種 啤酒酵母：將糖進行酒精

50、發(fā)酵，生成二氧化碳和乙醇。 3)原理 大麥經發(fā)芽得到麥芽。麥芽糖化所得糖在啤酒酵母作用下進行酒精發(fā)酵生成二氧化碳和乙醇。 同時，麥芽在發(fā)酵過程中產生了有機酸、高級醇和酯類，與啤酒花共同形成啤酒獨特的風味。 工藝流程 圖 操作要點： （1）麥芽制備 浸漬：精選大麥浸水至水分達43-48%。 發(fā)芽：浸漬后的大麥移至發(fā)芽箱，先調節(jié)溫度為13-15℃，隨后每天約增加1℃，保持適量水分和氧氣。8d完成發(fā)芽，得到生麥芽稱綠麥芽，約含45%水分。 焙炒：為防止綠麥芽過分生長，抑制麥粒中酶的作用以提高儲藏性，應立即焙炒與干燥至含水量為3%。焙炒過程中，麥芽中

51、的糖及氨基酸反應生成褐色色素，并除去生臭，使麥芽具有特有的香味和色澤，同時使根芽容易脫落。 干燥：僅進行焙炒往往達不到含水量要求，所以還必須進行干燥處理。為避免麥芽的萎縮硬化，初期低溫，隨后逐漸提高干燥溫度，最后80-85℃強熱3-5h，然后用除根機處理，除根是為了去除澀味。最后將成品麥芽儲藏與20℃以下。 （2）麥芽汁制備 糖化：將麥芽粉碎后與溫水混合，借助麥芽自身的各種水解酶，或適當添加α-淀粉酶， 在65℃下將淀粉和蛋白質等高分子物質進一步分解成可溶性低分子糖類、糊精、氨基酸、胨、肽等。 添加啤酒花、煮沸：糖化液經過濾加入啤

52、酒花0.18-0.2%（淡色啤酒），煮沸1-2h。過濾除去酒花殘渣，冷卻后移入發(fā)酵罐。 加入酒花煮沸的作用：使麥汁濃縮到適合濃度； 溶出酒花有效成分，增加麥汁的香氣、苦味、防腐能力；使麥汁殘留的蛋白質凝固除去，防止帶來渾濁，增進啤酒的透明度和穩(wěn)定性；破壞全部酶，具殺菌作用。 （3）主發(fā)酵 低泡期：接種后15-20h，發(fā)酵罐四周出現白沫并向中間擴展直至全液面。此期每天糖度下降1Bx，溫度上升0.9-1℃。 高泡期：發(fā)酵最旺盛期，泡沫特別豐盛，達20-30cm厚。降糖速度最快，可達每天1.5Bx。溫度上升很快，應密切注意降溫。此階段可維持2-4d。 落泡期：溫度開

53、始下降，降糖速度減慢，泡沫開始收縮，形成褐色泡蓋。當12度酒糖度降至3.8-4.8 Bx時，即可下酒進入后酵。此階段維持約2-3d。 （4）后發(fā)酵 下酒：將經主發(fā)酵的酒送入后酵罐（儲酒罐）稱為下酒。下酒前，先在儲酒罐里放滿無菌水，用二氧化碳將水壓出，充滿后，將酒液注入。要求盡可能一次灌成，流空隙10-15cm。 管理：下酒后先開口發(fā)酵。以防二氧化碳過多，酒沫涌出，2-3d后封口。下酒初期室溫2.8-3.2℃，以后逐漸降到0-1℃。12 Bx酒儲酒時間為1-3個月。 （5）過濾 經后發(fā)酵的啤酒，殘存酵母和蛋白質等沉積于底部或懸浮于酒中，需經過濾或分離。 常用分離方法有：濾棉法

54、，較古老，趨于淘汰；硅藻土法；離心分離法；板框過濾法；微孔薄膜過濾法。 ? 選擇方法的原則有產量大，質量高，損失小，勞動強度小，二氧化碳損失少，不易污染，不影響風味，不吸氧等。 （6）包裝 將鮮啤酒經超濾，則得生啤酒。 過濾后的啤酒，不經滅菌處理而作為鮮酒出售，這就是通常所稱的鮮啤酒。 將鮮啤酒用巴氏滅菌法滅菌，即裝瓶后，在60℃下保持20min，可殺死酵母和其他非孢子細菌，即得熟啤酒，可作較長時間的保存。 酒精發(fā)酵機制 乙醇生成途徑 見ZL1圖 巴斯德效應概念 在好氣條件下，酵母發(fā)酵能力降低的規(guī)律稱

55、為巴斯德效應。其現象是乙醇的積累減少，實質是細胞內糖代謝降低。 巴斯德效應機制 好氧，進入TCA，產生的檸檬酸、ATP抑制磷酸果糖激酶。 6-磷酸果糖積累，進而6-磷酸葡萄糖積累，抑制已糖激酶。 1，6-二磷酸果糖減少，對丙酮酸激酶激活作用減弱，磷酸烯醇式丙酮酸積累，抑制已糖激酶。 第七章 檸檬酸發(fā)酵機制 檸檬酸生產工藝 概述 檸檬酸是生物體主要代謝產物之一，在自然界分布很廣，主要存在檸檬、柑橘、鳳梨、無花果等果實中，尤其以未成熟者含酸量較多。檸檬酸具有令人愉快的爽口酸味，安全無毒，是發(fā)酵法生產的最重要有機酸。在水中的溶解度極高，能被生物體直接吸收代謝。 檸檬酸用途

56、 在食品工業(yè)上 用作清涼飲料、糖果業(yè)等的酸味料。 由于檸檬酸是水果的天然成分，不僅是良好的酸味劑，同時具有增溶、緩沖和抗氧化作用，使飲料中的其他成分交融協(xié)調，形成調和的口味和氣味。 也可用作油脂等的抗氧化劑。 在醫(yī)藥上 檸檬酸鈉用作輸血劑，檸檬酸鐵銨用作補血劑。同時可用于血液和血漿的保存，以及制造人造血漿等。 因為檸檬酸具有抗凝血作用，同時溶解度高，酸根能被直接吸收代謝而無積累。 在化學工業(yè)上 緩沖劑、催化劑、激活劑、增塑劑、鰲合劑、吸附劑、穩(wěn)定劑、消泡劑等 在日常生活中 保健飲品 原料與菌種： 1.糖質原料（常用）：此類原料可以是淀粉質

57、原料，如薯干，也可以是廢糖蜜。 菌種為黑曲霉。 2.石油原料：以石油中的十四碳到十八碳的直鏈烷烴混合物（即石蠟）為原料進行發(fā)酵。菌種為解脂假絲酵母。 工藝流程注釋 調漿 加入適量水，使薯干粉濃度為10～16%，調成漿狀。 接種培養(yǎng) 將薯干粉漿移入發(fā)酵罐，接入適量經培養(yǎng)的黑曲霉種子，在控制pH為2.0～2.5,溫度31℃左右下，培養(yǎng)發(fā)酵。 加熱,菌絲過濾 發(fā)酵液成熟后，將發(fā)酵液先加熱到100℃再用板框壓濾或真空抽濾進行過濾。 發(fā)酵液加熱到100℃目的：加熱可促使蛋白質凝固，加快過濾速度；可殺死微生物； 菌絲加熱后會膨脹破裂，可使檸檬酸釋放來，提

58、高收率 碳酸鈣中和 在發(fā)酵液中加入碳酸鈣，使檸檬酸轉化成難溶的檸檬酸鈣。 酸解 在得到的檸檬酸鈣中加入硫酸，用量一般為碳酸鈣的92～95%。酸解溫度為85℃，并過濾。 脫色 在85℃下，用活性炭或脫色樹脂柱除去色素。 樹脂法除金屬離子 采用離子交換樹脂，除去酸解液中混入的鈣、鐵等離子 濃縮與結晶 采用減壓濃縮，要求真空度600～740mmHg，溫度50～60℃下進行濃縮與結晶。 干燥 采用沸騰干燥箱。干燥溫度控制在35℃以下，否則會失去一部分結晶水影響成品的色澤。 檸檬酸生物合成途徑 見ZL11圖 葡萄糖經

59、過EMP途徑生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-COA；另一方面丙酮酸羧化作用生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰-COA在檸檬酸合成酶作用下縮合生成檸檬酸。 檸檬酸代謝調節(jié)機制的幾個問題 檸檬酸抑制磷酸果糖激酶，檸檬酸過量積累與EMP途徑的暢通存在尖銳的矛盾，這個矛盾如何解決？ 檸檬酸過量積累與EMP途徑暢通的矛盾如何解決？——1.錳離子缺乏抑制蛋白質合成，導致細胞內NH4+濃度升高，解除了檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制。2.有氧時黑曲霉走不產ATP的側系呼吸鏈，解除了ATP對磷酸果糖激酶的抑制。 檸檬酸要過量積累，三羧酸循環(huán)的大部分必然被阻斷，那么草酰乙酸從何而來？ PYR（丙酮

60、酸）+CO2→→→→→→→草酰乙酸+ADP+Pi（Keq=0.818丙酮酸羧化酶 其中以第一個反應為主? PEP （磷酸烯醇丙酮酸）+CO2→→→→草酰乙酸+ADP+ATP（Keq=0.049） 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 黑曲霉生產檸檬酸，有那些特有的優(yōu)勢？ 見書P59-63 檸檬酸為什么能過量積累？ o 錳離子缺乏，抑制蛋白質合成，導致NH4+濃度升高，有氧時黑曲霉走不產ATP的側系呼吸鏈，解除了對磷酸果糖激酶的抑制，促進EMP途徑暢通。 o 丙酮酸羧化酶不被調節(jié)控制，源源不斷提供草酰乙酸。 o 丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA和兩個CO2固定反應的平衡，及檸檬酸合成酶不被調節(jié)，

61、增強了合成檸檬酸的能力。 o 順烏頭酸水合酶催化建立檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，造成檸檬酸最初的積累。 o 檸檬酸的積累使pH值下降，抑制了異檸檬酸脫氫酶和順烏頭酸水合酶的活力，促進了自身進一步積累。 調節(jié)措施（總結）1、菌種 選育優(yōu)良菌株2、發(fā)酵條件 錳離子缺乏 有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右 第八章 谷氨酸發(fā)酵機制 味精生產工藝概述：L-谷氨酸一鈉鹽，俗稱味精，學名α-氨基戊二酸一鈉，分子式NaC5H8O4NH2O。它有強烈的肉類鮮味，用水稀釋至3000倍，仍能感覺到鮮味。故廣泛用于食品菜肴，一般用量為0.2-0.5%的濃度。

62、 生理功能： 被消化吸收構成人體組織中的蛋白質，并參與體內許多其它代謝過程?？膳c血氨結合生成谷氨酰胺，能解除組織代謝過程中產生的氨的毒害作用，從而可以預防和治療肝昏迷等病癥?？梢种茀捠嘲Y、偏食癥。長期食用，可提高神經有缺陷兒童的智力。 生產工藝 1、原料 淀粉 大米 廢糖蜜 淀粉糖化液 2、菌種 谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌 現普遍使用T613，優(yōu)點為耐高溫、生長快、產酸高。 3、工藝過程及原理 淀粉水解糖的制備 原理 將淀粉先用α-淀粉酶液化，后在高溫下加酸糖化得到葡萄糖。（酶酸法） 工藝流程 發(fā)酵 原理 使微生物在特定條件下改

63、變原來的代謝途徑，從而積累大量中間代謝產物—谷氨酸。 工藝流程 （斜面） （搖瓶） （種子罐） （發(fā)酵罐） 谷氨酸提取 原理 等電點鋅鹽法 1.谷氨酸在等電點時溶解度最低。將發(fā)酵液pH調至等電點3.22，在冷凍條件下谷氨酸析出。 2.谷氨酸母液仍為谷氨酸飽和溶液，利用谷氨酸鋅難溶的性質。采用冷凍pH6.3（谷氨酸鋅等電點）條件下，將谷氨酸鋅沉淀。 3.在酸性條件下，溶解谷氨酸鋅，再調pH至3.22，谷氨酸結晶析出。 工藝流程 粗谷氨酸制味精 原理 谷氨酸與碳酸鈉進行中和制成谷氨

64、酸鈉，才具有強力鮮味。同時經過一系列的精制過程，才得到符合質量標準的味精。 工藝流程 谷氨酸生物合成途徑 見ZL11圖 糖經酵解途徑（EMP）和磷酸己糖途徑（HMP）生成丙酮酸。丙酮酸經氧化脫羧生成乙酰-CoA，經CO2固定生成草酰乙酸，兩者合成檸檬酸進入三羧酸循環(huán)，由三羧酸循環(huán)的中間產物α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化下，還原氨基化合成谷氨酸。 谷氨酸代謝調節(jié)機制的幾個問題 谷氨酸合成有那些關鍵酶，這些酶對于谷氨酸合成的調節(jié)機制？ 1.EMP途徑與TCA循環(huán)中的一些關鍵酶。3個 己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶 2.在谷氨酸之前的酶活性需保

65、證。4個 檸檬酸合成酶 順烏頭酸水合酶 異檸檬酸脫氫酶 谷氨酸脫氫酶 3.在谷氨酸之后的酶活性需抑制。 2個 異檸檬酸裂解酶 α-酮戊二酸脫氫酶 谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋抑制如何消除？ NH4＋ 谷氨酸脫氫酶 葡萄糖→中間產物→a－酮戊二酸 谷氨酸 低濃度的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶有顯著的激活作用，只有較高濃度谷氨酸才抑制其自身的生成。 只要將培養(yǎng)基的生物素控制在一定的濃度，保證細胞膜的通透性，使得生成的谷氨酸能夠及時地滲透出來，則谷氨酸就不會對谷氨酸脫氫酶形成反饋抑制。 讀表5-3，解釋之。 現象： （1）

66、生物素貧乏培養(yǎng)基中積累大量谷氨酸，生物素豐富培養(yǎng)基中幾乎不積累谷氨酸。 （2）生物素貧乏培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞內谷氨酸含量較生物素豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的少，且較容易洗出。 機理： 生物素是脂肪酸生物合成中的輔酶，生物素缺乏時，不飽和脂肪酸合成受阻，造成磷脂含量不足，細胞膜結構不完整，提高了通透性，有利于谷氨酸分泌到培養(yǎng)基中，消除了谷氨酸對其自身合成的抑制，同時谷氨酸也較容易洗脫。 菌種選育模型與控制方法原理？ 1）生物素缺陷型2）油酸缺陷型3）甘油缺陷型4）溫度敏感突變株 谷氨酸分泌受細胞膜控制，影響細胞膜通透性的主要是膜中磷脂的含量。磷脂由不飽和脂肪酸、甘油、磷酸和側鏈組成，因此控制油酸、甘油等的合成可增加細胞膜通透性，從而有利于谷氨酸的滲透，消除反饋抑制。 調節(jié)措施（總結）1、菌種 選育，如對氟乙酸抗性菌株2、發(fā)酵條件 生物素限制 氟乙酸控制 錳離子缺乏？ 第九章 發(fā)酵工藝過程的控制 溫度的控制 溫度對微生物生長與發(fā)酵的影響 1、對菌體所有結構物質都有作用 2、直接