《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì)

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1、 《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì) 教學(xué)目標(biāo) (一)知識與技能 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 (二)過程與方法 體驗(yàn)血紅蛋白提取和分離的實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)格要求,注意按照操作提示進(jìn)行相關(guān)步驟 (三)情感、態(tài)度與價(jià)值觀 初步形成科學(xué)的思維方式,發(fā)展科學(xué)素養(yǎng)和人文精神 教學(xué)重難點(diǎn) 課題重點(diǎn) 凝膠色譜法的原理和方法 課題難點(diǎn) 樣品的預(yù)處理;色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填

2、教學(xué)工具 多媒體 教學(xué)過程 (一)引入新課 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者, 是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化和物。 對蛋白質(zhì)的研究有助于 人們對生 命過程的認(rèn)識和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì) 呢? (二)進(jìn)行新課 1.基礎(chǔ)知識 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì):形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差 萬 別,由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。 1.1 凝膠色譜法(分配色譜法): ( 1)原理:(圖 5- 13a)分子量大的分子通過多孔凝

3、膠顆粒的間隙,路程短,流動(dòng)快;分 子量小的 分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部,路程長,流動(dòng)慢。 ( 2 )凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。 ( 3 ) 分離過程: ( 圖 5 — 13b) 混合物上柱 T 洗脫 T 大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢 T 收集大分子 T 收集小分子 * 洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 1. 2 緩沖溶液 (1) 原理:由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)

4、堿弱酸鹽組成 ( 如 H2C0— NaHC03HC— NaC NaH2PO4/Na2HPO4 等 ) ,調(diào)節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同 pH的緩沖液。 (2) 緩沖液作用:抵制外界酸、堿對溶液 pH 的干擾而保持 pH 穩(wěn)定。 1. 3 凝膠電泳法: ( 1 ) 原理:不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同,在電場中受到的作用力大小、 方 向、阻力不同,導(dǎo)致不同 蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。 [思考]閱讀教材 后,填寫下表: 決定運(yùn)動(dòng)方

5、簡 旳成庫侖力 Q 形成阻力 4 決定運(yùn)頑速率 電荷牲質(zhì)鼻 電荷曇 Q “ 2| 分干形狀工 A 分子天 ?卜# 1 4 2 (2) 分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。 (3) 分離過 程:在一定 pH 下,使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電;加入帶負(fù)電荷多的 SDS形 成 “蛋白質(zhì) - SDS復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 2?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2.1 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟? 樣品處理、粗分離、

6、純化、純度鑒定。 思考:是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的?為什么? 不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來源和性質(zhì)不同,分離方法差別很大。 2.2 選擇實(shí)驗(yàn)材料 (1)你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中,最好哪種血液來提取血紅蛋白?為什么? 哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒有細(xì)胞核,血紅蛋白含量高。 ( 2)請閱讀教材,認(rèn)識哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問題: 血液由 和 兩部分 組成。 血細(xì)胞中 細(xì)胞數(shù)量最多,細(xì)胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構(gòu)成的,其中每個(gè)亞基中都含有

7、一個(gè)能與 02 和 C02 結(jié)合的 基團(tuán)。 2.3 從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過程為:洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透 析。洗滌紅 細(xì)胞的目的是什么? 除去血漿蛋白的雜蛋白,有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細(xì)胞的洗滌過程為 血液 +檸檬酸鈉 T 低速短時(shí)離心 T 吸出上層血漿 T 紅細(xì)胞 + 5 倍體積生理鹽水 T 緩慢攪拌 10min T 低速短時(shí)離心 T 吸出上清液 T 反復(fù)洗滌直至上清液無黃色 思考:加入檸檬酸鈉有何目的?為什么要低速、

8、短時(shí)離心?為什么要緩慢攪拌? 防止血液凝固;防止白 細(xì)胞沉淀;防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考:你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來? 加入蒸餾水,用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。 補(bǔ)充: 加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜, 有 利于血紅蛋白的釋放和分離。 此時(shí), 紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白, 而且還含有細(xì) 胞破碎 物、 脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。 怎樣除去這些雜質(zhì)呢?由于它們的密度不同, 科學(xué)家采 取了離心分離 的方法: 紅細(xì)胞破碎混合液 T 中速長時(shí)離

9、心 (2000c/min x 10min) T 濾紙過濾除去脂質(zhì) T 分液漏斗分 離出血紅蛋白 2.4 如何除無機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢?。 透析。半透膜的選擇透過性,大分子物質(zhì)不能通過半透 膜,離子和小分子能夠通過半透膜。 在透析過程中,血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到 pH= 7 的磷酸緩 沖液中。 思考:為何使用 pH= 7 的磷酸緩沖液?為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量? 維持血紅蛋白的正常 特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。 總結(jié):通過以上四個(gè)基

10、本過程, 紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來。 但其中還含有其他種類 的蛋白質(zhì) 分子 ( 如呼吸酶等 ) 。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢?我們來研究蛋白質(zhì)提 取和分離的第二個(gè)步驟 一一粗分離 ( 凝膠色譜操作 ) 。 2.5 凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括:制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖 5 - 19, 說出制作色譜柱需要的材料。 橡皮塞 2 個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程:準(zhǔn)備材料 T 加工橡皮塞 T 安裝色譜柱 下面進(jìn)行第二步 -

11、-- 凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材 : 色譜柱的裝填過程。 歩驟門 ①" 色謂枉垂亶固宦在支架斗 ? 操作鑒求昇 : 計(jì)算穗量 ifi 膠』 根據(jù)色厝柱怖積計(jì)算讖膠用堡屮 蘆膠顆粒亠蒸矍水 」充分溶脹 J 配制懸》拿襪門 凝膠 IS 粒+洗脫液 f 涕水浴 裝填懸浮液 一次性緩 幔倒入:輕 輕敲打 ⑤ 亠 緩沖液洗滌平衡 立刻用隣 酸緩神液洗湊平衝 樣品加入和洗脫。其基本過程是:

12、 調(diào)節(jié)緩沖液面 T 加入蛋白質(zhì)樣品 T 調(diào)節(jié)緩沖液面 T 洗脫 T 收集分裝蛋白質(zhì) 至此,血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過程中,應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng): ( 1 ) 紅細(xì)胞的洗滌: 洗滌次數(shù)不能過少;低速、短時(shí)離心。 ( 2 ) 凝膠的預(yù)處理: 沸水浴法時(shí)間短,還能除去微生物和氣泡 ( 3 ) 色譜柱的裝填: 裝填盡量緊密,降低顆粒間隙;無氣泡;洗脫液不能斷流。 (4) 色譜柱成功標(biāo)志:紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。課后小結(jié) 本課題重在讓學(xué)生了解生物科學(xué)在

13、蛋白質(zhì)領(lǐng)域的進(jìn)展, 說明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重 要性 和必要性, 并學(xué)習(xí)一些蛋白質(zhì)分離和提取的基本技術(shù)。 教師可以發(fā)揮學(xué)生的主動(dòng)性, 讓 學(xué)生介紹當(dāng) 前有關(guān)蛋白質(zhì)研究的新進(jìn)展, 激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣, 然后指出本課題的學(xué)習(xí)意義, 讓薛生初步體會分離純化蛋白質(zhì)的過程和方法 課后習(xí)題 1. 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是( ) A. 對其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對分子質(zhì)量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)

14、本質(zhì)大多是( ) A. 糖類化合物 B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì) D. 核酸 3. 選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料,有何好處() A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細(xì)胞無細(xì)胞核 C. 紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高 D. 紅細(xì)胞 DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時(shí),第二層是( ) A. 甲苯 B. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀 5. 血紅蛋白因含有( )而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D. 血紅素 答案: 1. D 2.A 3.A 4.D 5.D 板書 課題 3 血紅蛋白的提取和分離 1.基礎(chǔ)知識 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2.1 蛋白質(zhì)的提取和 分離一般分為哪些基本步驟?

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