第十四節(jié) DNA的粗提取與鑒定

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1、　　 DNA的粗提取與鑒定 主講：黃岡中學(xué)優(yōu)秀生物教師　王小敏 課題目標(biāo)： 1、通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的物理、化學(xué)性質(zhì)； 2、理解DNA粗提取與鑒定的原理。 課題重難點(diǎn)： DNA的粗提取和鑒定方法。 一、基礎(chǔ)知識(shí) （一）提取DNA的方法 1、提取生物大分子的基本思路 　　選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。 2、提取DNA的基本思路 　　利用DNA與RNA．蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。 3、DNA粗提取的原理 　?。?）DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解

2、度不同。 　　DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。 　　DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最?。辉?mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。 　?。?）DNA不溶于酒精 　　DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。 　?。?）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 　?、俚鞍酌浮獾鞍踪|(zhì)，對(duì)DNA沒(méi)有影響。 　?、诟邷亍蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。 　　③洗滌劑——溶解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 （二）DNA的鑒定 　　沸水浴條件下，DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色。

3、 　　原理總結(jié)：通過(guò)利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細(xì)胞中提取和提純DNA；再利用酒精進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，達(dá)到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （一）實(shí)驗(yàn)材料的選取 1、材料： 　　魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實(shí)驗(yàn)材料） 2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。 （二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液 1、動(dòng)物細(xì)胞——容易破碎 　　10mL雞血＋20mL蒸餾水→同

4、方向攪拌→3層尼龍布過(guò)濾→濾液 　　討論1：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？ 　　答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。 2、植物細(xì)胞 　?、僦参锛?xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜。 　　②實(shí)例：提取洋蔥DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。 　　討論2：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？ 　　答：研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不

5、到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 （三）去除濾液中的雜質(zhì) 　　最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步提純DNA。 　　閱讀教材提供的三種方法，分析其中的原理。 　　方案一：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)。具體做法是：在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)，再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 　　原理：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。 　　思考：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能

6、夠去除雜質(zhì)？ 　　答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。 　　方案二：直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。 　　方案三：將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15 min，注意嚴(yán)格控制溫度范圍。 　　討論3：方案二與方案三的原理有什么不同？ 　　答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。 （四）DNA的析出與鑒定 1、DNA的析出 用冷卻的

7、酒精析出DNA 　　DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2－3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。 2、DNA的鑒定 　　具體做法：試管2支，編號(hào)甲、乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化。 三、實(shí)驗(yàn)操作 四、操作提示 　　在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過(guò)濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細(xì)胞破裂快速攪拌）；玻棒不要

8、碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。為了提高DNA純度，在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中通常使用的洗滌劑有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）。 課堂小結(jié)： - 返回 - 　　 同步測(cè)試 一、選擇題 1、在研究DNA的基因樣本前，采集來(lái)的血樣需要蛋白水解酶處理，然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（　） A．除去血漿中的蛋白質(zhì) B．除去染色體上的蛋白質(zhì) C．除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì) D．除去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純 2、與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（?。? A．操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶

9、解度 B．在操作A時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整 C．加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度，兩者均可析出 D．當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCl的濃度相當(dāng)于0.14mol/L 3、洗滌劑能夠瓦解（?。?，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 A．細(xì)胞壁　　　　　　　　　　B．細(xì)胞膜 C．細(xì)胞核　　　　　　　　　　D．細(xì)胞質(zhì) 4、在沸水浴的條件下，DNA遇（?。?huì)被染成藍(lán)色。 A．斐林試劑　　　　　　　　　B．蘇丹Ⅲ染液 C．雙縮脲試劑　　　　　　　　D．二苯胺 5、在DNA提取過(guò)程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（　） A．不易破碎　　　　　　　　　B．減少提取過(guò)程中D

10、NA的損失 C．增加DNA的含量　　　　　　 D．容易洗刷 6、下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響最小的是（?。? A．使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì) B．?dāng)嚢钑r(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌 C．在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加 D．在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E．在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢? 7、DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（?。o置2-3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。 A．0.9%的NaCl B．0.14mol/L的NaCl溶液 C．質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的H

11、Cl D．體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液 8、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（?。乐寡耗?。 A．醋酸鈉　　　　　　　　　　B．龍膽紫 C．檸檬酸鈉　　　　　　　　　D．醋酸洋紅 9、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（?。? A．加快溶解DNA的速度 B．加快溶解雜質(zhì)的速度 C．減少DNA的溶解度，加快DNA析出 D．減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出 10、去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（?。┓纸獾鞍踪|(zhì)。 A．胃蛋白酶　　　　　　　　B．胰蛋白酶 C．木瓜蛋白酶　　　　　　　D．腸肽酶 DCBDB BDCCC

12、 二、非選擇題 11、提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁矗? 顯示答案 　　11、因?yàn)樯锨逡菏茄獫{，不含有血細(xì)胞，DNA存在于沉郁試管底部的雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，所以提取雞血中的DNA時(shí)，要除去血液中的上清液。 12、填寫(xiě)本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。 （1）提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì)____________________。 （2）溶解核內(nèi)DNA：____________________。 （3）析出2mol/LNaCl溶液中的DNA____________________。 （4）DNA粘稠物的再溶解____________________。 （5）提

13、取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物____________________。 （6）DNA的鑒定____________________。 顯示答案 12、（1）蒸餾水 （2）2mol/L NaCl溶液 （3）蒸餾水 （4）2mol/L NaCl溶液 （5）冷卻的95%的酒精 （6）二苯胺 13、關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇，也經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較，最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么？請(qǐng)回答下列問(wèn)題： 　?。?）雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞__________，家雞屬于鳥(niǎo)類(lèi)，新陳代謝旺盛，因而血液中__________細(xì)胞樹(shù)木較多，可以提供豐富的__________。 　　

14、（2）實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要原因是____________________。 　　（3）生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便，若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是__________，這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中__________，但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)開(kāi)___________________。 　　（4）若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加__________程序，使組織細(xì)胞更易分離。 顯示答案 13、（1）含細(xì)胞核；紅；DNA （2）雞血細(xì)胞液中DNA相對(duì)含量 （3）很難提

15、取到DNA；無(wú)細(xì)胞核；肝細(xì)胞有細(xì)胞核 （4）研磨 -END- 　　 課外拓展 以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取 　　課前準(zhǔn)備將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。 　　提取DNA的具體步驟 　　1、取材稱(chēng)取30g菜花，去梗取花，切碎。 　　2、研磨將碎菜花放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。 　　研磨液的配制方法如下。將10.1g Tris加入到50mL蒸餾水中，使其溶解，然后，用2mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，再加入8.76g NaCl、37.2g EDTA、20g SDS。待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定

16、容至1000mL。 　　教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑，使植物細(xì)胞膜破碎，釋放DNA。學(xué)生可以設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA都采用一種陽(yáng)離子去污劑——十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液，使細(xì)胞膜破碎，同時(shí)將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開(kāi)，再用氯仿—異丙醇混合液（體積比為24∶1）抽提去除雜質(zhì)蛋白，得到高純度的DNA。 　　3、過(guò)濾在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液過(guò)濾到燒杯中（有條件的學(xué)?？蓪V液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000r/min的轉(zhuǎn)速，離心2～5min，取上清液放入燒杯中）。在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。

17、　　4、沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷乙醇溶液中，并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤海úＡО舨灰辈宓綗撞浚?。沉?～5min后，可見(jiàn)白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 ? -END- 　　 高考解析 例1、有人將豬血取出后，經(jīng)過(guò)濾獲得豬血細(xì)胞液，經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)步驟后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)效果與下列哪類(lèi)動(dòng)物相同（　） A．兩棲類(lèi)　　　　　　B．魚(yú)類(lèi)　　　　　　C．爬行類(lèi)　　　　　　D．鳥(niǎo)類(lèi)　　　　　　E．沒(méi)有相同的 答案：E 解析： 　　豬紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，上述四類(lèi)動(dòng)物的紅細(xì)胞中均有細(xì)胞核。 例2、在DNA的粗提取

18、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是（?。? A．稀釋血液、沖洗樣品 B．使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出 C．使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量　　 D．使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA 答案： B 解析： 　　第一次加入蒸餾水的作用是使血細(xì)胞過(guò)度吸水而破裂，以便核內(nèi)物質(zhì)釋放。第二次加入適量蒸餾水，是為了降低NaCl濃度，使DNA因溶解度達(dá)到最小而析出。 例3、檢測(cè)DNA物質(zhì)的試劑是（　） A．斐林試劑　　　　　　　　　B．95%的酒精 C．甲基綠溶液　　　　　　　　D．二苯胺試劑 答案： C、D 解析： 　　甲基綠溶液和二苯胺試劑均可鑒定 DNA。DNA遇甲基綠溶液呈綠色，DNA遇二苯胺試劑呈藍(lán)色。 例4、下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響較小的是（?。? A．使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì) B．?dāng)嚢钑r(shí)，要用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪動(dòng) C．在析出DNA黏稠物時(shí)，要緩緩加蒸餾水，直至溶液中黏稠物不再增多 D．在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E．在DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢? 答案：B 解析： 　　在B所述的操作中，可以保證DNA分子的完整性，但不影響提取量。除了A、C、D、E影響DNA的提取量外，使用塑料器皿也可以減少DNA在操作中的損失。 -END-