第十四節(jié) DNA的粗提取與鑒定

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1、   DNA的粗提取與鑒定 主講:黃岡中學(xué)優(yōu)秀生物教師 王小敏 課題目標(biāo): 1、通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取,了解DNA的物理、化學(xué)性質(zhì); 2、理解DNA粗提取與鑒定的原理。 課題重難點(diǎn): DNA的粗提取和鑒定方法。 一、基礎(chǔ)知識(shí) (一)提取DNA的方法 1、提取生物大分子的基本思路   選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。 2、提取DNA的基本思路   利用DNA與RNA.蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異,提取DNA,去除其他成分。 3、DNA粗提取的原理  ?。?)DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解

2、度不同。   DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。   DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小;在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。  ?。?)DNA不溶于酒精   DNA不溶于酒精溶液,但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。  ?。?)DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性  ?、俚鞍酌浮獾鞍踪|(zhì),對(duì)DNA沒(méi)有影響。  ?、诟邷亍蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)不能忍受60~80℃,而DNA在80℃以上才會(huì)變性。  ?、巯礈靹芙饧?xì)胞膜,去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 (二)DNA的鑒定   沸水浴條件下,DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色。

3、   原理總結(jié):通過(guò)利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以從細(xì)胞中提取和提純DNA;再利用酒精進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái),達(dá)到提純的目的;最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (一)實(shí)驗(yàn)材料的選取 1、材料:   魚(yú)卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。(從中選取2~3種實(shí)驗(yàn)材料) 2、原則:凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織,成功的可能性更大。 (二)破碎細(xì)胞,獲取含DNA的濾液 1、動(dòng)物細(xì)胞——容易破碎   10mL雞血+20mL蒸餾水→同

4、方向攪拌→3層尼龍布過(guò)濾→濾液   討論1:為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂?   答:蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體,水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞脹裂,再加上攪拌的機(jī)械作用,就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂),從而釋放出DNA。 2、植物細(xì)胞   ①植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑和食鹽溶解細(xì)胞膜。  ?、趯?shí)例:提取洋蔥DNA時(shí),在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽,進(jìn)行充分的攪拌和研磨,過(guò)濾后收集研磨液。   討論2:如果研磨不充分,會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?   答:研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全,提取的DNA量變少,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致看不

5、到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 (三)去除濾液中的雜質(zhì)   最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì),需要進(jìn)一步提純DNA。   閱讀教材提供的三種方法,分析其中的原理。   方案一:利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的不同,通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)。具體做法是:在濾液中加入NaCl,使NaCl溶液濃度為2mol/L,過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì),再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14mol/L,析出DNA,過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì),再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。   原理:DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。   思考:為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能

6、夠去除雜質(zhì)?   答:用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽溶液使DNA析出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。   方案二:直接在濾液中加入嫩肉粉,反應(yīng)10~15min,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)。   方案三:將濾液放在60~75℃的恒溫水浴箱中保溫10~15 min,注意嚴(yán)格控制溫度范圍。   討論3:方案二與方案三的原理有什么不同?   答:方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi);方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同,從而使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離。 (四)DNA的析出與鑒定 1、DNA的析出 用冷卻的

7、酒精析出DNA   DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%),靜置2-3min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物,這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸取上面的水。 2、DNA的鑒定   具體做法:試管2支,編號(hào)甲、乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物,使之溶解→各加4mL二苯胺,混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化。 三、實(shí)驗(yàn)操作 四、操作提示   在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固;雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度;使用塑料燒杯;使用尼龍布過(guò)濾;玻棒沿同一方向攪拌;玻棒攪拌要緩慢(細(xì)胞破裂快速攪拌);玻棒不要

8、碰到燒杯壁;二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。為了提高DNA純度,在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中通常使用的洗滌劑有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)。 課堂小結(jié): - 返回 -    同步測(cè)試 一、選擇題 1、在研究DNA的基因樣本前,采集來(lái)的血樣需要蛋白水解酶處理,然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是( ) A.除去血漿中的蛋白質(zhì) B.除去染色體上的蛋白質(zhì) C.除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì) D.除去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì),使DNA釋放,便于進(jìn)一步提純 2、與析出DNA粘稠物有關(guān)的敘述,不正確的是( ) A.操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水,降低DNA的溶

9、解度 B.在操作A時(shí),用玻璃棒輕緩攪拌,以保證DNA分子完整 C.加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)的溶解度,兩者均可析出 D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí),此時(shí)NaCl的濃度相當(dāng)于0.14mol/L 3、洗滌劑能夠瓦解(?。?,但對(duì)DNA沒(méi)有影響。 A.細(xì)胞壁          B.細(xì)胞膜 C.細(xì)胞核          D.細(xì)胞質(zhì) 4、在沸水浴的條件下,DNA遇( )會(huì)被染成藍(lán)色。 A.斐林試劑         B.蘇丹Ⅲ染液 C.雙縮脲試劑        D.二苯胺 5、在DNA提取過(guò)程中,最好使用塑料試管和燒杯,目的是(?。? A.不易破碎         B.減少提取過(guò)程中D

10、NA的損失 C.增加DNA的含量       D.容易洗刷 6、下列操作中,對(duì)DNA的提取量影響最小的是(?。? A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂,放出DNA等核物質(zhì) B.?dāng)嚢钑r(shí),要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌 C.在“析出DNA粘稠物”時(shí),要緩緩加蒸餾水,直至溶液中粘稠物不再增加 D.在用酒精沉淀DNA時(shí),要使用冷酒精,甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E.在DNA的溶解和再溶解時(shí),要充分?jǐn)嚢? 7、DNA的粗提取中,將與濾液體積相等的、冷卻的( ),靜置2-3min,溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。 A.0.9%的NaCl B.0.14mol/L的NaCl溶液 C.質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的H

11、Cl D.體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液 8、以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),需要向血液中加入( ),防止血液凝固。 A.醋酸鈉          B.龍膽紫 C.檸檬酸鈉         D.醋酸洋紅 9、在向溶解DNA的NaCl溶液中,不斷加入蒸餾水的目的是( ) A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解雜質(zhì)的速度 C.減少DNA的溶解度,加快DNA析出 D.減小雜質(zhì)的溶解度,加快雜質(zhì)的析出 10、去除濾液中的雜質(zhì)時(shí),直接在濾液中加入嫩肉粉,利用嫩肉粉中的(?。┓纸獾鞍踪|(zhì)。 A.胃蛋白酶        B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶       D.腸肽酶 DCBDB BDCCC

12、 二、非選擇題 11、提取雞血中DNA時(shí),要除去血液中的上清液,這是因?yàn)槭裁矗? 顯示答案   11、因?yàn)樯锨逡菏茄獫{,不含有血細(xì)胞,DNA存在于沉郁試管底部的雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中,所以提取雞血中的DNA時(shí),要除去血液中的上清液。 12、填寫(xiě)本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。 (1)提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì)____________________。 (2)溶解核內(nèi)DNA:____________________。 (3)析出2mol/LNaCl溶液中的DNA____________________。 (4)DNA粘稠物的再溶解____________________。 (5)提

13、取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物____________________。 (6)DNA的鑒定____________________。 顯示答案 12、(1)蒸餾水 (2)2mol/L NaCl溶液 (3)蒸餾水 (4)2mol/L NaCl溶液 (5)冷卻的95%的酒精 (6)二苯胺 13、關(guān)于DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇,也經(jīng)過(guò)了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較,最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么?請(qǐng)回答下列問(wèn)題:  ?。?)雞血細(xì)胞中紅細(xì)胞__________,家雞屬于鳥(niǎo)類,新陳代謝旺盛,因而血液中__________細(xì)胞樹(shù)木較多,可以提供豐富的__________。   

14、(2)實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料,而不用雞全血,主要原因是____________________。   (3)生活在牧區(qū)的人們,采集牛、羊和馬血比較方便,若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后,結(jié)果是__________,這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣,成熟的紅細(xì)胞中__________,但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。這是因?yàn)開(kāi)___________________。  ?。?)若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料,在提取之前,最好增加__________程序,使組織細(xì)胞更易分離。 顯示答案 13、(1)含細(xì)胞核;紅;DNA (2)雞血細(xì)胞液中DNA相對(duì)含量 (3)很難提

15、取到DNA;無(wú)細(xì)胞核;肝細(xì)胞有細(xì)胞核 (4)研磨 -END-    課外拓展 以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取   課前準(zhǔn)備將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。   提取DNA的具體步驟   1、取材稱取30g菜花,去梗取花,切碎。   2、研磨將碎菜花放入研缽中,倒入10mL研磨液,充分研磨10min。   研磨液的配制方法如下。將10.1g Tris加入到50mL蒸餾水中,使其溶解,然后,用2mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,再加入8.76g NaCl、37.2g EDTA、20g SDS。待上述藥品全部溶解后,再用蒸餾水定

16、容至1000mL。   教材中建議采用洗發(fā)香波、洗滌劑等一些去污劑,使植物細(xì)胞膜破碎,釋放DNA。學(xué)生可以設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn),比較哪一種方法可以提取到純度更高的DNA。一般實(shí)驗(yàn)室提取高純度的DNA都采用一種陽(yáng)離子去污劑——十六烷三甲基溴化銨分離緩沖液,使細(xì)胞膜破碎,同時(shí)將DNA與植物中多糖等雜質(zhì)分開(kāi),再用氯仿—異丙醇混合液(體積比為24∶1)抽提去除雜質(zhì)蛋白,得到高純度的DNA。   3、過(guò)濾在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液過(guò)濾到燒杯中(有條件的學(xué)??蓪V液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心,用1000r/min的轉(zhuǎn)速,離心2~5min,取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。

17、  4、沉淀將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的預(yù)冷乙醇溶液中,并用玻璃棒緩緩、輕輕地?cái)嚢枞芤海úAО舨灰辈宓綗撞浚?。沉?~5min后,可見(jiàn)白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn),將絮狀物纏繞在玻璃棒上。 ? -END-    高考解析 例1、有人將豬血取出后,經(jīng)過(guò)濾獲得豬血細(xì)胞液,經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)步驟后,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)效果與下列哪類動(dòng)物相同(?。? A.兩棲類      B.魚(yú)類      C.爬行類      D.鳥(niǎo)類      E.沒(méi)有相同的 答案:E 解析:   豬紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核,上述四類動(dòng)物的紅細(xì)胞中均有細(xì)胞核。 例2、在DNA的粗提取

18、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是(?。? A.稀釋血液、沖洗樣品 B.使血細(xì)胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出 C.使血細(xì)胞破裂、增大DNA溶解量   D.使血細(xì)胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA 答案: B 解析:   第一次加入蒸餾水的作用是使血細(xì)胞過(guò)度吸水而破裂,以便核內(nèi)物質(zhì)釋放。第二次加入適量蒸餾水,是為了降低NaCl濃度,使DNA因溶解度達(dá)到最小而析出。 例3、檢測(cè)DNA物質(zhì)的試劑是(?。? A.斐林試劑         B.95%的酒精 C.甲基綠溶液        D.二苯胺試劑 答案: C、D 解析:   甲基綠溶液和二苯胺試劑均可鑒定 DNA。DNA遇甲基綠溶液呈綠色,DNA遇二苯胺試劑呈藍(lán)色。 例4、下列操作中,對(duì)DNA的提取量影響較小的是( ) A.使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂,放出DNA等核物質(zhì) B.?dāng)嚢钑r(shí),要用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪動(dòng) C.在析出DNA黏稠物時(shí),要緩緩加蒸餾水,直至溶液中黏稠物不再增多 D.在用酒精沉淀DNA時(shí),要使用冷酒精,甚至再將混合液放入冰箱中冷卻 E.在DNA的溶解和再溶解時(shí),要充分?jǐn)嚢? 答案:B 解析:   在B所述的操作中,可以保證DNA分子的完整性,但不影響提取量。除了A、C、D、E影響DNA的提取量外,使用塑料器皿也可以減少DNA在操作中的損失。 -END-

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