基因工程的操作過(guò)程.ppt

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4基因工程的操作過(guò)程,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）,ADNA的體外重組（切、接）,,4基因工程的操作過(guò)程,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,切,接,轉(zhuǎn),增,檢,ADNA的體外重組（切與接）,4基因工程的操作過(guò)程,同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,,同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,,,重組率,同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,5,5,,EcoRI,,,,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,,,,T4-DNAligase,5,,5,,,,5,,5,,同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接,BamHI,,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,,5,GATCA,T,5,,,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,,,T4-DNAligase,5,,5,,BclI,,G,CCTAG,GATCC,G,,,5,GATCA,T,,,,5,,5,,重組率,重組率的定義,重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。,重組率,提高重組率的方法,提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1,載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)：,5,5,,EcoRI,,,5,G,CTTAAp,AATTC,G,5p,5,,5,AATTC,G,5HO,,,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-AG,,5,,GA-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,,,,,OH,HO,OH,HO,堿性磷酸單酯酶,堿性磷酸單酯酶,B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）,4基因工程的操作過(guò)程,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增,,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài),,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：,100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體,用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心,用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液懸浮菌體,冰浴放置12-24小時(shí)，備用,收集菌體,,,,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：,取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組,冰浴放置半小時(shí),在42℃保溫2分鐘（熱脈沖）,快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1-2分鐘,DNA連接液，混勻,,,,,加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時(shí)（擴(kuò)增）,涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選,,,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子,酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù),電穿孔轉(zhuǎn)化,將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的定義,轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)）,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的定義,例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4X1011個(gè)分子（6.02X1017/2686X660），也就是說(shuō)，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞另一方面，在實(shí)際操作過(guò)程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說(shuō)，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18DNA,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的用途,利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模,例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，,經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè),重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？,若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個(gè)重組克隆需要：,104/107X10-2=0.1mg載體DNA,考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為：,0.1/20%=0.5mg載體DNA,載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算,出（5mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,載體及DNA重組分子方面：,載體本身的性質(zhì)：,不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同,載體的空間構(gòu)象：,質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載,體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的,超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí),插入片段的大?。?對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,受體細(xì)胞方面：,受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高,轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率的影響因素,轉(zhuǎn)化方法方面：,受體細(xì)胞的預(yù)處理：影響最大,供受體的比例：,Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細(xì)胞50ngDNA,轉(zhuǎn)化方法：,Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109個(gè)原生質(zhì)體50ngDNA,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNA,l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA,電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增,擴(kuò)增操作,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增,擴(kuò)增操作的目的,增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序,擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選,表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定,,,,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,4基因工程的操作過(guò)程,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),,克隆DNA序列檢測(cè),,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),,C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）,4基因工程的操作過(guò)程,由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)化子,重組子,目的重組子,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),抗藥性篩選法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ROP,,,,,,,,,ROI,,,,,,,,,,,,,,SalI,BamHI,Tc,r,,PvuI,PstI,PstI,EcoRI,ClaI,HindIII,HindII,BalI,Ap,r,抗藥性篩選法的基本原理：,pBR322,4363bp,ori,,,,,,,抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非,轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子,將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：,非重組子呈Apr、Tcr,重組子呈Apr、Tcr,將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：,非重組子呈Apr、Tcr,重組子呈Apr、Tcs,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),抗藥性篩選法,抗藥性篩選法的基本操作：,先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板,再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至,含有Ap和Tc的平板上,在Ap平板上生長(zhǎng)、但在Ap和Tc,平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap,Ap+Tc,,,影印,挑選,,,,重組子,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法,營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：,營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法,常見的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記：,哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條dTTP的合成途徑：,用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激,酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型,dCDP,,dTDP,,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,,,,,TK,AP氨基喋呤,TK胸腺嘧啶核苷激酶,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),顯色篩選法,顯色篩選法的基本原理：,顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等,載體遺傳標(biāo)記檢測(cè),顯色篩選法,顯色篩選法的基本操作：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Ap+X-gal,,重組子（Apr+lacZ-）,將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分重組子與非重組子,用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,電泳觀察酶解產(chǎn)物片段,重組子：2.7kb+4.0kb,非重組子：2.7kb,如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然,后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為重組子,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,S,S,B,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分重組子與非重組子,如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)镾phI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達(dá)到目的，但這兩種酶的價(jià)格只及SphI的1/50,,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,,B,B,E,P,4.0kb,1.0kb,0.8kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,目的重組子：3.0kb+3.7kb,或者：1.0kb+5.7kb,用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA,目的重組子：3.2kb+3.5kb,或者：0.8kb+5.9kb,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,全酶解圖譜法：,,,,,,,B,B,E,4.0kb,2.0kb,2.0kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,對(duì)圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現(xiàn)2.0kb和2.7kb兩條帶子，實(shí)際上2.0kb的條帶中含有兩種不同的分子,,,,,,2.7kb,2.0kb,,E,克隆DNA序列檢測(cè),限制性酶切圖譜法,部分酶解圖譜法：,該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)：,BamHI全酶解：0.60.81.83.4kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.60.81.81.22.2kb,其中，1.2kb片段的存在表明該片段位于一端,BamHI部分酶解：1.42.64.0kb,其中，1.4kb的片段必為0.6kb和0.8kb兩片段，表,明兩者是連在一起的；同理，2.6kb的片段必為0.8,kb和1.8kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，,4.0kb的片段必為0.6kb和3.4kb兩片段，表明兩者,是連在一起的,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù),,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,菌落原位雜交法的基本操作：,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板,洗滌,雜交,感光,用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜,用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜,80℃烘干固定影印薄膜,薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫,用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜,用X光膠片覆蓋薄膜感光,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的制備：,用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：,單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）,足夠長(zhǎng)度（至少12個(gè)堿基）,內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū),探針的制備方法或來(lái)源包括：,人工合成,cDNA合成,同源序列,mRNA,,,,,,,,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標(biāo)記：T4-PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記,,5‘HO,,3‘HO,OH3‘,OH5‘,,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,,5‘p,,3‘HO,OH3‘,p5‘,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標(biāo)記：逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記,3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5’mRNA,,反轉(zhuǎn)錄酶,Mg2+dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）,5’TTTTTTTTTTT,5’mRNA,3’cDNA,3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT,5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標(biāo)記：ABC熒光標(biāo)記,,,,,,,,,,,,GCTTGAGCAGTAACCTG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光胺,,Biotin生物素,,Avidin,生物素結(jié)合蛋白,,烷烴連接臂,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標(biāo)記：ABC顯色酶標(biāo)記,,,,,,GCTTGAGCAGTAACCTG,顯色酶,,Biotin生物素,,Avidin生物素結(jié)合蛋白,,烷烴連接臂,,,,,,,,,,,,,生色底物,顏色產(chǎn)物,克隆DNA序列檢測(cè),菌落噬菌斑原位雜交法,雜交探針的標(biāo)記：地高辛系統(tǒng)標(biāo)記,,,,,,dUTP-連接臂-甾醇半抗原,digoxigeninDIG,抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物,克隆DNA序列檢測(cè),DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本原理：,,,DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國(guó)際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過(guò)位點(diǎn)特異性終止測(cè)定DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：,DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600bp/601bp）,電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序,用于DNA測(cè)序的專一性試劑盒（Kit）,,,,,克隆DNA序列檢測(cè),DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本操作：,,,,,,,DNA聚合反應(yīng),聚丙烯酰胺凝膠電泳,,,,克隆DNA序列檢測(cè),DNA序列分析法,雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本反應(yīng)：,,,,,Klenow,OH3,5P,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,T,dNTP+ddATP,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,T,T,T,T,T,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,OH3,5P,,,,,,,,,,,,A,G,T,C,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法,淀粉酶目的基因的鑒定：,淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶,淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶于水,的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將,待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可,其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性,的多糖或單糖。因此，目的重組子菌落周圍會(huì)形成透明圈。如果透,明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，,易于辨認(rèn)。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進(jìn)行鑒定,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法,抗菌素抗性基因的鑒定：,抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長(zhǎng)出的菌落即是含有目的基因的目的重組子在實(shí)際操作過(guò)程中，由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落，即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法,抗菌素抗性基因的鑒定：,,,,,,,,,,,,,,,,,,,目的重組子,,誘導(dǎo)抗性,,,,抽取重組質(zhì)粒,再次轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法,DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定：,,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用聚乙烯薄膜影印裂解平板,洗滌,雜交,感光,輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定,80℃烘干固定影印薄膜,與探針溶液中雜交,洗滌、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板,聚乙烯膜,探針選用能與,目標(biāo)蛋白特異,性結(jié)合的DNA,片段,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法,雜交釋放轉(zhuǎn)譯鑒定：,,,,,,,,,合并,變性,掛柱,制備,上樣,淋洗,洗脫,翻譯,測(cè)活,重組DNA,單鏈DNA,mRNA,雜交的mDNA,蛋白質(zhì),蛋白質(zhì),無(wú)細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)：麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法,放射免疫原位雜交鑒定：,,影印,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印,洗滌,與I125標(biāo)記的IgG保溫,感光,輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定,與I125標(biāo)記的IgG保溫,洗滌、干燥、感光,用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板,含抗體的聚乙烯膜,裂解平板,,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法,免疫沉淀鑒定：,在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體,,然后涂布轉(zhuǎn)化液,,,37℃培養(yǎng),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會(huì)分泌出目標(biāo),蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀,反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑,此法簡(jiǎn)便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大,外源基因產(chǎn)物檢測(cè),聚丙烯酰胺凝膠電泳法,如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測(cè)定生物活性，又無(wú)現(xiàn)成的抗體使用，則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行粗略的篩選,,