優(yōu)《血紅蛋白的提取和分離》

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1、 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并 了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。 1、主要概念： 凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)?血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。 2. 主要原理： 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理 3、課題重點(diǎn)： 凝膠色譜法的原理和方法 4、 課題難點(diǎn)： 樣品的處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。 1.分離生物大分子的基本思路： 選用一定的 物理或化學(xué) 的方法分離具有不同物 理或化學(xué)性質(zhì)的 生物大分子 。 2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理： 根據(jù)蛋白質(zhì) 各種特性 的差異，如 分子的形狀和 大小、

2、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì) 和對(duì)其他分子的親和力 等等，可以用來(lái)分離 不同種 類(lèi)的蛋白質(zhì)。 一、血紅蛋白的提取和分離 3、提取分離方法 凝膠色譜法 凝膠電泳法 （一） 凝膠色譜法（ 分配色譜法 ） 2.凝膠： 大多數(shù)凝膠是由 多糖類(lèi)化合物 （如葡聚糖或瓊 脂糖）構(gòu)成的多孔小球體 ， 內(nèi)部有許多貫穿的 通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量 的大小， 利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行 分離。 1.概念： 3.凝膠色譜法的原理 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)， 相對(duì) 分子量較小的蛋白質(zhì) 容易 進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道， 路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢 ; 相對(duì)分子量 較大 的蛋白質(zhì) 無(wú)法進(jìn)入

3、凝膠內(nèi)部的 通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速 度較快。 依據(jù)的特性是： 蛋白質(zhì)分子量的大小。 4.凝膠色譜法 分離蛋白質(zhì) 的原理和 具體過(guò)程 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示 （二）緩沖溶液 1.概念 : 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制 外加少量強(qiáng) 酸或強(qiáng)堿 的影響使原來(lái)溶液 PH值基本保持 不變的混 合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液 PH值的影響， 維持 PH基本不變。 2.作用 : 思考：說(shuō)出人體血液中緩沖對(duì)。 NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3 通常由 1 2 種緩沖劑 溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié) 緩沖劑的 使用比例 就可以制得在 不同 PH范圍內(nèi)使用的

4、 緩沖液。 4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是 :__________ , 利用緩沖液 模擬細(xì)胞內(nèi)的 PH環(huán)境 ，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能 ，便于觀察 (紅色 )和科 學(xué)研究 (活性 ) 磷酸緩沖液 3.緩沖溶液的配制 : 其目的是 : （三） 電泳： 1.概念： 帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 2.原理： 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解離的基團(tuán)，在 一定的 PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正 電或負(fù)電。 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶 電荷 相反 的電極移動(dòng)。 分離樣品中各種分子 帶電性質(zhì)的差異以及分子本 身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷 移速度，

5、 從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素 決定 運(yùn)動(dòng)方向 形成 庫(kù)侖力 形成 阻力 決定 運(yùn)動(dòng)速率 電荷性質(zhì) 電荷量 分子形狀 分子大小 3.類(lèi)型 : 瓊脂糖 凝膠電泳、 聚丙稀酰胺 凝膠電泳。 在 電場(chǎng) 的作用下， 這 些 帶電 分子 會(huì) 向著 與 其所 帶電 荷相 反的 電極 移 動(dòng) 瓊脂糖凝膠電泳示意圖 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1、測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 :常用 十二烷基硫酸鈉 （ SDS） 聚丙烯酰胺 凝膠電泳。 聚丙烯酰胺凝膠是由 單體丙烯酰胺 和 交聯(lián)劑 N,N - 亞甲基雙丙烯酰胺 在 引發(fā)劑 和 催化劑 的作用下聚合交聯(lián) 成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 N,N-亞甲基

6、雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)） 丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的 遷移率 取決 于它所帶 凈電荷的多少 以及 分子的大小 等因素。 2.原理： SDS能使 蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。解聚成單條 肽鏈 ，因此測(cè)定的結(jié)果只是 單條肽鏈的分子量 。 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 ， SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子 原有 的電荷量 。因而 掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差 別， 使 電泳遷移率完全取決于分子的大小 。 3. SDS作用機(jī)理 : 用 SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 測(cè)定蛋 白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用

7、一組 已知分子量 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白 同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子 量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的 電泳區(qū)帶位置 ，可以測(cè)定 未知蛋白質(zhì) 的分子量。 市場(chǎng)上有高分子量、 次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出 售。 二、實(shí)驗(yàn)操作 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 1.樣品處理： （一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （二）操作過(guò)程 可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液來(lái) 分離血紅蛋白。 血 液 血漿 水 分 固體物質(zhì)： 血漿蛋白、 無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等 血細(xì)胞 白細(xì)胞 血小板 紅細(xì)胞 （最多） 血紅蛋白 （ 90） 兩個(gè) 肽鏈 兩個(gè) 一肽鏈 四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán) 2.提問(wèn)： 血液有哪些成分？ 1.提問(wèn)： 用雞的紅細(xì)胞提取 DNA，

8、用豬、牛、羊的 紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？ 雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有 DNA，便于進(jìn)行 DNA 的提?。蝗说募t細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋 白含量豐富，便于提取血紅蛋白。 血紅蛋白 兩個(gè) 肽鏈 兩個(gè) 一肽鏈 四個(gè)亞鐵 血 紅素基團(tuán) 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè) 亞鐵血紅素基團(tuán)， 此基團(tuán)可攜帶 一分子 O2或一分子 CO2， 血紅蛋白因含有 血紅素 而 呈 紅色 。 血紅蛋白的特點(diǎn)： (1)紅細(xì)胞的洗滌 : 去除雜質(zhì)蛋白，利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 . 1、采集血樣 2、低速短時(shí)間離心 （速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì) 胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果） 3、吸取血漿： 上層透明的黃色血漿。 4、鹽水

9、洗滌： 下層暗紅色的紅細(xì)胞 +五倍體積的 0.9 的 NaCl溶液洗滌，攪拌 10min 5、低速 短時(shí)間 離心： 6、重復(fù) 3、 4、 5步驟三次 上清液中已沒(méi)有黃色：紅細(xì)胞洗滌干凈。 目的 : 操作： 洗滌次數(shù)過(guò)少 ,無(wú)法除去血漿蛋白。 (2)血紅蛋白的釋放： 加蒸餾水到 原血液體積 ， 加 40體積的甲苯 （溶解細(xì)胞膜） 置于 磁力攪拌器 攪拌 10min（加速細(xì)胞破裂） 紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白 (3)分離血紅蛋白溶液： 過(guò)程 ： 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以 2000r/min的速 度 離心 10 min。 試管中溶液層次： 第 1層（最上層）： 甲苯層 （無(wú)色透明）； 第 2

10、層（中上層）： 脂溶性物質(zhì)沉淀層 （白色薄層固體）； 第 3層（中下層）： 血紅蛋白的水溶液層 （紅色透明液體）； 第 4層（最下層）： 雜質(zhì)沉淀層 （暗紅色）。 分離 ： 濾紙過(guò)濾：除去脂溶性沉淀層， 分液漏斗中靜置：分出下層的 紅色透明液 體 。 甲苯層 （ 無(wú)色透明） 白色薄層固體 紅色透明液體 雜質(zhì)沉淀層 （ 暗紅色 ） 試管中溶液層次 (4)透 析： 過(guò)程： 取 1ml的血紅蛋白溶液 裝入透 析袋中，將透析袋放入盛有 300ml的 20mmol/l的磷酸緩沖 液 中（ pH為 7.0），透析 12h 目的： 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)和離子。 或用于更換樣品的緩沖液。 20mmol/

11、L磷酸緩沖液 1mL 透析過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示 2.凝膠色譜操作 : （ 1）凝膠色譜柱的制作： 取長(zhǎng) 40厘米，內(nèi)徑 1.6厘米的玻璃管， 兩端磨平。 底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用 100目尼龍紗包好，插到玻璃管的 一 端 。 注意事項(xiàng)：玻璃管的 上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還 會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。 頂塞的制作： 打孔 安裝玻璃管 。 組裝： 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體 。 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 （ 2）凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇： A、材料： 交聯(lián)葡聚糖凝膠（ G-75）。 B、代表意義 ： “ G” 表示凝膠的交聯(lián)程度

12、，膨脹程度 及分離范圍 。 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨 脹時(shí)吸水 7.5克。 凝膠的前處理： 配置凝膠懸浮液： 計(jì)算并稱(chēng)取一定量的凝膠浸泡于 蒸餾水或洗脫液 中 充分溶脹后，配成 凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法： A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。 B、裝填：將 凝膠懸浮液一次性 緩慢倒入色譜柱 內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻 注意： 1、裝填時(shí)盡量緊密： 降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在： 因?yàn)闅馀輹?huì)攪 亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果 。 洗滌平衡： 連接緩沖液洗脫瓶，在 50cm高的 操作壓下，用 300ml的 20mmol/L的

13、磷酸緩沖液（ pH為 7.0） 充分洗滌 平衡 12h。 注意： 1、液面不要低于凝膠表面，否則 可能有氣泡混入，影響分離效果 2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝 膠顆粒的現(xiàn)象 。 （ 2）凝膠色譜柱的裝填 50cm高 （ 3）樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面： 打開(kāi)下端出口，使 緩沖液下降到與凝膠面 平齊，關(guān)閉出口 滴加透析樣品 ： 吸管吸 1ml樣品加到色譜柱的 頂端 ， 注意： 1、不要觸及并破壞凝膠面。 2、貼壁加樣 3、吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣 樣品滲入凝膠床： 打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)， 樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口 洗脫： 加入 pH=7.0 的 20mmol/l的磷酸

14、緩沖液到適當(dāng)高度， 連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。 收集： 待 紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端 時(shí)，用試管收集流出 液，每 5ml收集一試管，連續(xù)收集 。 （如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） （ 3）樣品加入與洗脫 注意： 正確的加樣操作是： 1、不要觸及并破壞凝膠面。 2、貼壁加樣。 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。 思考下面的問(wèn)題： 讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的 pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和 功能正常。 1、在血紅蛋白純化的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩 沖液處理的目的是什么？ 2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點(diǎn)？ 這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？ 血紅蛋白是有色蛋白，因此在

15、凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò) 觀察 顏色 來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋 白的分離過(guò)程 非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 血紅蛋白提取和分離的程序包括： 樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定 。 樣品的處理： 通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、 離心等操作收集到 血紅蛋白溶液 ， 樣品的粗分離 :透析 去除分子量較小的雜質(zhì) 樣品的純化： 凝膠色譜法 除去 相對(duì)分子質(zhì)量較大 的 雜質(zhì)蛋白 純度鑒定 :聚丙烯酰胺凝膠電泳 進(jìn)行純度鑒定。 3、你能描述血紅蛋白分離的完整過(guò)程嗎？ （三） SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做） 2.試劑的配制： 鑒定血紅蛋白純度。 1.目的： 3.方法步驟：（略） 觀察處理的

16、血液樣品離心后 是否分層，如果分層不明顯， 可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。 此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使 白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 一同沉淀 ，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取 純度。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處 理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？ 2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜 柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 1、 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以 在凝膠柱旁放 一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 2、加入大分子的有色物質(zhì)， 例如藍(lán)色葡聚糖 2000或紅色 葡聚糖 ， 觀察色帶移動(dòng)的情況。如果 色帶均勻、狹窄、平 整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好 。 3、 色譜柱出現(xiàn) 紋路或是氣泡 ， 輕輕敲打柱體以消除氣泡， 消除不了時(shí)要重新裝柱。 紅色區(qū)帶：均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出； 說(shuō)明凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確 紅色區(qū)帶：歪曲、散亂、變寬， 說(shuō)明分離的效果不好， 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中紅色區(qū)帶的移 動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離 效果？ 啟動(dòng) I n t e r n e t E x p l o r e r 瀏覽器. l n k