《蛋白質工程》課件

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1、蛋白質工程與食品產(chǎn)業(yè) 內容n一、蛋白質的功能與結構n二、蛋白質工程的誕生n三、蛋白質工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應用 一、蛋白質的功能與結構n 1.1蛋白質的功能n 1.2蛋白質的結構 1.1蛋白質的功能n (1)蛋 白 質 是 構 成 生 命 的 重 要 物 質 之 一n 蛋 白 質 是 一 類 重 要 而 復 雜 的 生 物 大 分 子 ， 它 廣 泛 地 存 在于 所 有 生 物 界 的 機 體 之 中 ， 具 有 許 多 重 要 的 作 用 ：n 構 成 生 物 體 新 陳 代 謝 的 幾 乎 全 部 的 化 學 反 應 都 是 在 活 性蛋 白 質 -酶 的

2、 催 化 下 進 行 的 ；n 高 等 動 物 的 免 疫 反 應 ， 也 主 要 是 通 過 蛋 白 質 即 抗 原 和 抗體 來 完 成 的 ； n 運 動 時 的 肌 肉 收 縮 靠 的 是 某 些 蛋 白 質 的 相 互 作 用 來 完 成的 ；n 運 輸 氧 和 二 氧 化 碳 的 是 血 紅 蛋 白 ；n 具 有 代 謝 和 調 節(jié) 功 能 的 是 多 種 蛋 白 質 激 素 。 n (2) 蛋 白 質 的 應 用n 蛋 白 質 是 人 類 賴 以 維 持 生 命 的 重 要 營 養(yǎng) 來 源 之一 。 人 們 需 要 從 各 種 肉 、 蛋 、 奶 、 豆 類 等 主 要 食 品中

3、 獲 得 所 需 的 蛋 白 質 營 養(yǎng) 。n 用 蛋 白 質 診 斷 和 治 療 某 些 疾 病 。 淀 粉 酶 、 脂 肪酶 、 蛋 白 酶 用 于 幫 助 消 化 ， 治 療 某 些 消 化 不 良 性 疾病 ； 胰 島 素 用 于 治 療 嚴 重 的 糖 尿 病 ； 轉 氨 酶 作 為 肝病 變 的 指 標 等 。n 食 品 工 業(yè) 和 輕 工 業(yè) 中 主 要 應 用 蛋 白 質 或 利 用 蛋白 質 的 性 質 制 造 各 種 產(chǎn) 品 。 例 如 ， 釀 造 業(yè) 要 用 蛋 白酶 來 增 加 醬 油 的 鮮 味 等 。 用 于 人 類 衣 著 的 羊 毛 、 紡織 品 和 皮 革 主

4、 要 組 成 是 蛋 白 質 。 1.2蛋白質的結構n 氨 基 酸 是 蛋 白 質 的 基 本 結 構 單 位 ， 各 種 氨 基 酸 之 間 通 過肽 鍵 彼 此 按 直 線 形 頭 尾 相 連 ， 構 成 不 同 長 短 的 肽 鏈 。肽 鍵 的 形 成 n 肽 鏈 又 以 一 定 方 式 折 疊 盤 繞 成 獨 特 的 空 間 結 構 ， 這 時 才 產(chǎn) 生 具 有生 物 活 性 的 天 然 蛋 白 質 。n 多 肽 鏈 的 折 疊 可 分 為 四 種 不 同 層 次 的 結 構 。 一 級 結 構 ： 僅 指 肽 鏈中 的 氨 基 酸 線 型 排 列 順 序 ， 不 考 慮 空 間 的

5、 排 列 。 牛 胰 島 素 的 氨 基 酸 序 列 n 二 級 結 構 ： 主 鏈 原 子 的 局 部 空 間 排列 ， 不 包 括 側 鏈 構 象 和 與 其 他 鏈 段的 相 互 關 系 ， 如 -螺 旋 、 -折 疊 等主 鏈 構 象 單 元 就 是 二 級 結 構 。 -螺 旋 三 級 結 構 ： 蛋 白 質 的 多 肽 鏈 在 各 種 二 級 結 構 的 基 礎 上 再進 一 步 盤 曲 或 折 疊 形 成 具 有 一 定 規(guī) 律 的 三 維 空 間 結 構 。 碳 酸 酐 酶 的 多 肽 骨 架 示 意 圖 n 四 級 結 構 ： 具 有 二 條 或 二 條 以 上 獨 立 三

6、級 結 構 的 多 肽鏈 組 成 的 蛋 白 質 ， 其 多 肽 鏈 間 通 過 次 級 鍵 相 互 組 合 而形 成 的 空 間 結 構 。 其 中 ， 每 個 具 有 獨 立 三 級 結 構 的 多肽 鏈 單 位 稱 為 亞 基 。 四 級 結 構 實 際 上 是 指 亞 基 的 立 體排 布 、 相 互 作 用 及 接 觸 部 位 的 布 局 。 如 血 紅 蛋 白 分 子中 四 個 亞 基 之 間 的 空 間 關 系 。血 紅 蛋 白 的 結 構 內容n一、蛋白質的功能與結構n二、蛋白質工程的誕生n三、蛋白質工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應用 二、蛋白質工程的誕

7、生n 蛋 白 質 工 程 是 指 基 于 蛋 白 質 結 構 功 能 的研 究 結 果 ， 通 過 基 因 工 程 技 術 ， 改 造 現(xiàn)有 蛋 白 質 和 設 計 制 造 新 蛋 白 質 ， 因 而 也稱 為 第 二 代 基 因 工 程 。 n 美 國 斯 坦 福 大 學 的 Charles Yanofsky教 授 ， 在 1987年 的 美 國 微生 物 學 會 的 年 會 上 說 ， 生 物 理 論 和 技 術 在 下 列 九 方 面 的 發(fā)展 促 進 了 蛋 白 質 工 程 的 誕 生 。 新 的 克 隆 技 術 ， 特 別 是 完整 的 cDNA的 克 隆 技 術 ； 快 速 測 定

8、 DNA序 列 的 方 法 ； 從DNA序 列 推 算 蛋 白 質 序 列 的 較 好 的 計 算 機 程 序 系 統(tǒng) ； 蛋白 質 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 的 建 立 ， 使 一 級 結 構 相 似 的 蛋 白 質 能 被 很快 地 鑒 定 出 來 ， 并 由 此 研 究 其 功 能 上 的 相 似 性 ； 對 原 核生 物 和 真 核 生 物 基 因 表 達 調 控 的 進 一 步 深 入 了 解 ； 用 于基 因 體 外 誘 變 的 化 學 、 酶 學 和 合 成 技 術 的 進 展 ； X-光 晶體 學 的 進 展 ， 包 括 較 好 的 長 晶 體 策 略 、 同 步 輻 射 的 應 用

9、 、電 子 區(qū) 域 檢 測 器 的 出 現(xiàn) ， 以 及 計 算 機 輔 助 的 數(shù) 據(jù) 分 析 ； 用 計 算 機 圖 像 系 統(tǒng) 為 工 具 直 接 觀 察 晶 體 數(shù) 據(jù) ； 核 磁 共 振技 術 的 改 進 ， 使 溶 液 中 的 原 子 分 布 能 得 到 直 接 檢 測 。 內容n一、蛋白質的功能與結構n二、蛋白質工程的誕生n三、蛋白質工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應用 三、蛋白質工程的基本步驟和改造方法n 3.1 蛋白質工程研究的基本步驟n 3.2 蛋白質改造方法 3.1 蛋白質工程研究的基本步驟n 分 離 純 化 目 的 蛋 白 ， 使 之 結 晶 并 作

10、 X晶 體 衍 射 分 析 ， 結合 核 磁 共 振 等 其 他 方 法 的 分 析 結 果 ， 得 到 其 空 間 結 構的 盡 可 能 多 的 信 息 。n 對 目 的 蛋 白 的 功 能 作 詳 盡 的 研 究 ， 確 定 它 的 功 能 域 。n 通 過 對 蛋 白 質 的 一 級 結 構 、 空 間 結 構 和 功 能 之 間 的 相互 關 系 的 分 析 ， 找 出 關 鍵 的 基 團 和 結 構 。n 在 蛋 白 質 結 構 與 功 能 研 究 的 基 礎 上 ， 借 助 于 計 算 機 圖像 顯 示 和 分 子 輔 助 設 計 ， 提 出 對 目 的 蛋 白 分 子 的 改 建

11、或 構 建 方 案 ， 并 用 基 因 工 程 的 方 法 去 實 施 。 n 對 經(jīng) 過 改 造 的 蛋 白 質 進 行 功 能 性 測 定 ， 看 看 改 造 的 效果 如 何 。 蛋 白 質 工 程 的 程 序 3.2 蛋白質改造方法n 3.2.1 天然蛋白質的改造n 3.2.1.1 基因的定向誘變技術n 3.2.1.2 結構域的拼接 3.2.1.1 基因的定向誘變技術n 一 般 ， 含 有 單 一 或 少 數(shù) 幾 個 突 變 位 點 的基 因 定 向 改 變 可 以 采 用 M13-DNA寡 聚 核苷 酸 介 導 誘 變 技 術 、 寡 核 苷 酸 介 導 的PCR誘 變 技 術 、

12、隨 機 誘 變 技 術 和 盒 式 突變 技 術 。 （1）M13-DNA寡聚核苷酸介導誘變技術.將 要 改 造 的 蛋 白 質 的 目 的 基 因 插 入 到 M13單 鏈 DNA中作 為 模 板 ， 以 含 有 要 改 變 的 堿 基 的 一 段 寡 聚核 苷 酸 作 為 引 物 ， 在 體 外 用 DNA聚 合 酶 進 行雙 鏈 DNA的 合 成 ， 用 DNA連 接 酶 連 接 成 環(huán)狀將 雜 合 DNA雙 鏈 再 轉 入 大 腸 桿 菌 中 將 含 突 變 目 的 基 因 的 M13噬 菌 體 篩 選 出 來 ，提 取 它 們 的 DNA， 用 限 制 性 內 切 酶 把 突 變 目

13、的 基 因 切 下 ， 并 重 組 到 表 達 質 粒 中 （2）寡核苷酸介導的PCR誘變技術將目的基因克隆到質粒載體上設計兩對引物由于兩個反應物中引物的位置不同，PCR擴增后，產(chǎn)物有不同的末端 將兩管PCR產(chǎn)物混合、變性、復性、退火，形成有兩個切口的環(huán)狀DNA，轉入大腸桿菌。 （3）隨機誘變技術將 待 突 變 基 因 克 隆 到 質 粒 上 ， 使 基因 旁 有 兩 個 特 殊 的 限 制 性 酶 切 位 點用 大 腸 桿 菌 核 酸 外 切 酶 EIII從3 -凹 陷 端 降 解 DNA 用 修 復 后 的 質 粒 轉 化 大 腸 桿 菌 大 腸 桿 菌 DNA聚 合 酶 的 Klenow

14、片 段 是 完 整 的DNA聚 合 酶 的 一 個 片段 ， 只 有 在 5 3聚 合酶 活 性 和 3 5 外 切酶 活 性 ， 失 去 了 5 3外 切 酶 活 性反 應 一 段 時 間 后 終 止 反 應 ， 再 用Klenow片 段 補 平 （4）盒式突變技術在目標基因中選擇合適的限制性內切酶位點用含有突變序列的DNA片段來置換目標基因上的一段DNA序列產(chǎn)生突變序列被集中在目標基因的一個特定區(qū)域的突變家族 產(chǎn)生突變序列被集中在目標基因的一個特定區(qū)域的突變家族 n 進 行 盒 式 突 變 ， 需 要 解 決 兩 個 關 鍵 問 題 ：n 一 個 是 在 目 標 基 因 序 列 中 ， 要

15、 有 適 當 的 限 制 性 內 切酶 識 別 位 點 ， 使 得 用 以 取 代 天 然 DNA序 列 的 盒 式 突 變序 列 可 以 有 效 地 插 入 到 目 標 基 因 中 。n 另 一 個 是 ， 如 何 得 到 各 種 合 適 的 、 用 以 取 代 目 標 基因 中 特 定 DNA片 段 的 突 變 DNA片 段 。 值 得 注 意 的 是 ，突 變 序 列 的 兩 端 必 須 分 別 具 有 與 目 標 基 因 上 相 匹 配 的的 限 制 性 內 切 酶 識 別 位 點 。 n 盒 式 突 變 技 術 的 實 際 應 用 ：n 加 酶 洗 衣 粉 是 人 們 日 常 生 活

16、 中 常 用 的 東 西 ， 在 洗 衣粉 中 常 加 入 的 酶 是 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶 。 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶有 一 個 弱 點 ， 一 遇 到 漂 白 劑 ， 就 會 被 破 壞 而 失 去 活 性。 枯 草 桿 菌 酶 氧 化 失 活 的 原 因 是 由 于 第 222位 的 甲 硫 氨酸 的 被 氧 化 造 成 的 ， 但 還 不 知 道 哪 一 種 氨 基 酸 替 換 甲硫 氨 酸 能 維 持 酶 的 活 性 ， 并 同 時 使 它 具 有 抗 氧 化 的 特性 。 使 用 盒 式 突 變 技 術 ， 1985年 發(fā) 現(xiàn) 只 有 半 光 氨 酸 取代 的 突 變 酶

17、 活 力 比 原 酶 提 高 138%， 并 可 在 過 氧 化 氫 （一 種 氧 化 劑 ） 存 在 小 時 不 丟 失 酶 活 力 。 這 樣 就 制 成了 合 乎 需 要 的 漂 白 加 酶 洗 衣 粉 了 。 3.2.1.2 結構域的拼接n 結 構 域 是 蛋 白 質 構 象 中 二 級 結 構 與 三 級 結 構 之 間 的 一個 層 次 。 在 較 大 的 蛋 白 質 分 子 中 ， 由 于 多 肽 鏈 上 相 鄰的 超 二 級 結 構 緊 密 聯(lián) 系 ， 形 成 二 個 或 多 個 在 空 間 上 可以 明 顯 區(qū) 別 它 與 蛋 白 質 亞 基 結 構 的 區(qū) 別 。n 結 構

18、 域 拼 接 是 通 過 基 因 操 作 把 位 于 兩 種 不 同 蛋 白 質 上的 幾 個 結 構 域 連 接 在 一 起 ， 形 成 融 合 蛋 白 ， 它 兼 有 原來 兩 種 蛋 白 的 性 質 。 n 金 屬 硫 蛋 白 是 一 類 小 分 子 量 的 球 蛋 白 ， 哺 乳 動 物 中 的 金 屬硫 蛋 白 分 子 由 61個 氨 基 酸 殘 基 組 成 ， 分 為 兩 個 結 構 域 ， 分別 叫 結 構 域 和 結 構 域 。 結 構 域 能 結 合 4個 金 屬 離 子 ， 趨向 于 與 鎘 和 汞 結 合 ； 而 結 構 域 能 結 合 3個 金 屬 離 子 ， 趨 向于

19、 與 鋅 和 銅 結 合 。 實 驗 表 明 ， 結 構 域 結 合 鎘 的 能 力 比 結構 域 高 出 1000倍 以 上 。n 用 計 算 機 分 子 模 型 軟 件 對 金 屬 硫 蛋 白 的 空 間 結 構 進 行 分 析表 明 ， 天 然 金 屬 硫 蛋 白 的 兩 個 結 構 域 之 間 具 有 較 大 的 獨 立性 ， 是 可 以 拆 分 和 構 建 的 ， 因 而 構 建 結 構 域 的 “ 二 倍 體 ”的 設 想 是 可 行 的 。n 用 化 學 合 成 的 方 法 分 別 合 成 結 構 域 和 連 接 肽 段 的 基 因 ， 并設 法 將 它 們 拼 接 起 來 。

20、再 插 入 載 體 并 轉 入 植 物 細 胞 中 ， 使金 屬 硫 蛋 白 的 結 構 域 多 倍 體 基 因 在 植 物 中 表 達 。 3.2.2 合成全新蛋白質n 基 于 天 然 蛋 白 質 結 構 改 造 的 蛋 白 質 工 程可 以 優(yōu) 化 蛋 白 質 的 活 性 ， 而 全 新 蛋 白 質設 計 是 合 成 具 有 新 奇 的 結 構 與 功 能 的 新蛋 白 質 。 從 頭 設 計 一 個 蛋 白 質 的 基 本 步 驟 ： 構 建 一 個 多 肽 鏈 骨 架模 型從 已 知 三 維 結 構 的 數(shù) 據(jù) 庫 中 挑 選 出一 個 合 適 的 片 段 ， 進 行 修 改 和 組

21、合 依 據(jù) 氨 基 酸 殘 基 的 統(tǒng) 計 學 數(shù) 據(jù) 和 排列 的 優(yōu) 先 順 序 ， 確 定 每 個 殘 基 位 置上 的 氨 基 酸優(yōu) 化 目 標 蛋 白 的 三 維 模 型 檢 驗 和 考 核 所 給 定 的 目 標 蛋 白 質 結構 是 否 合 理 ， 對 所 設 計 的 模 型 做 進一 步 修 正 幾 輪 的 設 計 、 檢 驗 和 再 設 計 ， 獲 得一 個 正 確 折 疊 和 帶 有 人 們 預 期 功 能的 目 標 蛋 白 質 內容n一、蛋白質的功能與結構n二、蛋白質工程的誕生n三、蛋白質工程的基本步驟和改造方法n四、蛋白質工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應用 四、蛋白質工程在食品產(chǎn)業(yè)

22、中的應用n 在 實 際 生 產(chǎn) 中 ， 可 以 應 用 蛋 白 質 工 程 對 一些 生 產(chǎn) 中 重 要 酶 或 蛋 白 質 性 質 加 以 改 造 ，提 高 現(xiàn) 有 酶 或 蛋 白 質 的 工 業(yè) 實 用 性 ， 如 提高 酶 的 熱 穩(wěn) 定 性 、 改 變 酶 的 最 適 pH值 條件 、 提 高 酶 的 催 化 活 性 等 。 例 如 ， 通 過 引入 二 硫 鍵 ， 改 善 酶 的 熱 穩(wěn) 定 性 。 n 溶 菌 酶 是 一 種 廣 泛 應 用 于 食 品 工 業(yè) 的 酶 制 劑 ， 其 催 化 速 率隨 溫 度 升 高 而 升 高 ， 因 此 ， 它 的 熱 穩(wěn) 定 性 是 提 高

23、其 應 用 潛力 的 重 要 標 準 。n 蛋 白 質 晶 體 結 構 研 究 表 明 ， T4溶 菌 酶 分 子 的 一 個 重 要 特 性是 在 第 97位 和 54位 殘 基 上 是 兩 個 未 形 成 二 硫 鍵 的 半 胱 氨 酸 ，所 以 ， 設 想 通 過 在 分 子 中 增 加 一 對 或 數(shù) 對 二 硫 鍵 ， 來 提 高酶 熱 穩(wěn) 定 性 。n 研 究 表 明 ， 采 用 定 位 突 變 技 術 使 該 菌 肽 鏈 第 9位 和 第 164位 氨基 酸 殘 基 轉 變 為 半 胱 氨 酸 ， 并 形 成 一 對 二 硫 鍵 ， 獲 得 的 突變 體 的 酶 活 性 高 于 天 然 酶 6%， 熔 點 溫 度 提 高 6.4度 ， 顯 然 ，新 引 入 的 “ 工 程 二 硫 鍵 ” 能 夠 穩(wěn) 定 兩 個 結 構 域 之 間 的 相 對位 置 ， 進 而 穩(wěn) 定 了 由 兩 個 結 構 域 所 形 成 的 活 性 中 心 。 思考題n 1.什 么 是 蛋 白 質 工 程 ？ 它 與 基 因 工 程 有 何關 聯(lián) ？n 2.什 么 是 定 位 突 變 技 術 ？ 它 包 括 哪 些 常 用方 法 ？