高中生物《血紅蛋白的提取和分離》教案4新人教版選修

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1、 課題：血紅蛋白的提取和分離 教學目標： 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學重點： 凝膠色譜法的原理和方法 教學難點： 樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填教學過程： （一）引入新課 蛋白質是生命活動的主要承擔者， 是細胞內含量最高的有機化合物。 對蛋白質的研究有 助于人們對生命過程的認識和理解。 所以需要從細胞中提取蛋白質進行研究。 怎樣提取蛋白質呢？ （二）進行新課 1．基礎知識 蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質

2、、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。 1． 1 凝膠色譜法（分配色譜法） ： （ 1）原理：（見課件圖） 分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。 （ 2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 （ 3）分離過程： 混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子＊洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。 1． 2 緩沖溶液 （ 1）原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成 （如 H2CO3－

3、 NaHCO3，HC－ NaC，NaH2PO4/Na2HPO4 等），調節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同 pH 的緩沖液。 （2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液 pH 的干擾而保持 pH 穩(wěn)定。 1． 3 凝膠電泳法： （ 1）原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。 ［思考］閱讀投影補充材料后，填寫下表： 決定運動 形成庫 形成 決定運動 方向 侖力 阻力 速率 電荷 √ 性質 電荷

4、 √ √ 量 分子 √ √ 形狀 分子 √ √ 用心 愛心 專心 1 大小 （2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經膠電泳等。 （3）分離過程：在一定 pH 下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的 SDS，形成“蛋白質－ SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。 2．實驗設計 2.1 蛋白質的提取和分離一般分為哪些基本步驟？ 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。 思考：是否所有種類的蛋白質的提取和

5、分離都是這樣的？為什么？ 不是。因為蛋白質的來源和性質不同，分離方法差別很大。 2.2 選擇實驗材料 （ 1）你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高。 （ 2）請閱讀投影資料，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質。并思考回答下列問題： 血液由 和 兩部分組成。 血細胞中 細胞數量最多，細胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構成的，其中每個亞基中都含有一個能與 O2 和 CO2結合的 基團。 2.3 從紅細胞中分離出血紅蛋白的過程為： 洗滌紅細胞、 釋放

6、血紅蛋白、 分離血紅蛋白、 透析。洗滌紅細胞的目的是什么？ 除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細胞的洗滌過程為 血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細胞＋ 5 倍體積生理鹽水 →緩慢 攪拌 10min→低速短時離心→吸出上清液→反復洗滌直至上清液無黃色 思考：加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？ 加入蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。 補充：加入蒸餾水后紅細胞液體積與

7、原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細胞膜， 有利于血紅蛋白的釋放和分離。 此時，紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白， 而且還含有 細胞破碎物、脂質、 甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質呢？由于它們的密度不同，科學家采取了離心分離的方法： 紅細胞破碎混合液→中速長時離心（ 2000c/min 10min ）→濾紙過濾除去脂質→分液漏 斗分離出血紅蛋白 2.4 如何除無機鹽離子和小分子有機物質呢？。 透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質不能通過半透膜，離子和小分子能夠通過半透 膜。 在透析過程中， 血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過半透膜擴散

8、進入到 pH＝ 7 的磷 酸緩沖液中。 思考：為何使用 pH＝7 的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？ 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質分子充分地向外擴散。 總結：通過以上四個基本過程，紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質分子（如呼吸酶等） 。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來呢？我們來研究蛋白 質提取和分離的第二個步驟――粗分離（凝膠色譜操作） 。 2.5 凝膠色譜分離蛋白質包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 用心 愛心 專心 2 根據教材圖 5－ 19，說出制作色譜柱

9、需要的材料。 橡皮塞 2 個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過程：準備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材： 色譜柱的裝填過程。 步驟 操作要求 ① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計算稱量凝膠 根據色譜柱體積計算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入；輕輕敲打 ⑤ 緩沖液洗滌平衡 立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h 樣品加入和

10、洗脫。其基本過程是： 調節(jié)緩沖液面→加入蛋白質樣品→調節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質至此，血紅蛋白即可得到粗分離。在整個操作過程中，應當注意以下事項： （ 1）紅細胞的洗滌：洗滌次數不能過少；低速、短時離心。 （ 2）凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡 （ 3）色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。 （ 4）色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。 （三）課堂總結、點評 血 蛋白質分子的差異性 紅 蛋 凝膠色譜法 原 理 分離過程

11、 白 凝膠電泳法 的 提 緩沖溶液 組 成 作 用 取 和 蛋白質的 樣品處理 粗 分 離 分 離 提取分離 純度鑒定 純 化 （四）實例探究 例 1 利用凝膠色譜法，什么樣的蛋白質先洗脫出來（ ） A. 相對分子質量大的 B. 溶解度高的 C.相對分子量小的 D.所代電荷多的 解析：凝集色譜法使根據相對分子質量的大小分

12、離蛋白質的有效方法。相對分子質量較 小的蛋白質能進入凝膠內部通道， 路程較長， 移動速度較慢； 相對分子質量大的蛋白質，路程較短，移動速度較快，首先洗脫出來。 答案： A 例 2 蛋白質提取和分離分為哪幾步（ ） A. 樣品處理、凝膠色譜操作、 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 用心 愛心 專心 3 B. 樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定 解析：蛋白質的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。 A 中凝膠色 譜操作及 SDS－聚丙

13、烯酰胺凝膠電泳為實驗操作過程中的技術 答案： C ☆綜合應用 例 3 用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質（ ） A 路程較長，移動速度較慢 B 路程較長，移動速度較快 C路程較短，移動速度較慢 D 路程較短，移動速度較快 解析：在小球體內部有許多貫穿的通道， 當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時， 相 對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道， 路程較長， 移動速度較慢； 而相對 分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道， 只能在凝膠外部移動， 路程較短， 移 動速度較快。 答案： D （五）鞏固練習 1.

14、 凝膠色譜法分離蛋白質的依據是（ ） A. 對其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對分子質量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學本質大多是（ ） A. 糖類化合物B. 脂質 C. 蛋白質D. 核酸 3. 選用紅細胞作為分離蛋白質的實驗材料，有何好處（ ） A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細胞無細胞核 C. 紅細胞蛋白質含量高 D. 紅細胞 DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時，第二層是（ ） A. 甲苯 B

15、. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質的沉淀層 D. 其他雜質的沉淀 5. 血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D. 血紅素 6. 下列操作正確的是（ ） A. 分離紅細胞時采用低速長時間離心 B. 紅細胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可 C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時間離心 D. 透析時要用 20mmol/l 的磷酸緩沖液，透析 12h 7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是（ ） A. 先加入 1ml 透析后的樣品 B. 加樣前要

16、使緩沖液緩慢下降全部流出 C. 如果紅色帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功 D. 洗脫時可以用緩沖液也可以用清水 8. 下列有關提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯誤的是（ ） A. 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B. 通過透析可以去除樣品中分子質量較大的雜質，此為樣品的粗提取 C. 可通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化 D. 可通過 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 用心 愛心 專心 4 9. 凝膠色譜法操作正確的是（ ） A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底

17、狀的凹穴 B. 將橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 將尼龍網剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片 10. 樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（ ） A. 加樣前， 打開色譜柱下端的流出口， 使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面 B. 加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內 C. 等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口 D. 用吸管小心的將 1ml 透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面 ★ 教后小記 本課題重在讓學生了解生物科學在蛋白質領域的進展， 說明提取、 分離高純度的蛋白質 的重要性和必要性， 并學習一些蛋白質分離和提取的基本技術。 可以發(fā)揮學生的主動性， 讓 學生介紹當前有關蛋白質研究的新進展， 激發(fā)學生的學習興趣， 然后指出本課題的學習意義， 讓學生初步體會分離純化蛋白質的過程和方法。 用心 愛心 專心 5