2019-2020年高中生物 （人教大綱版）第二冊 學(xué)生實(shí)驗(yàn) 1DNA粗提取與鑒定(備課資料).doc

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2019-2020年高中生物 （人教大綱版）第二冊 學(xué)生實(shí)驗(yàn) 1DNA粗提取與鑒定(備課資料) 一、二苯胺試劑的配制 A液：1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加1.5 mL濃硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結(jié)晶狀態(tài)，則需加溫后待其熔化，再使用。 B液：乙醛的體積分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液。 配制：將0.1 mL B液加入到10 mL A液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。 二、實(shí)驗(yàn)原理的補(bǔ)充介紹 1.DNA的釋放：DNA位于雞血細(xì)胞的細(xì)胞核中，正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細(xì)胞核中釋放出來，實(shí)驗(yàn)中采用了向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法。蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說，是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞破裂。同時(shí)，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），于是釋放出DNA，當(dāng)然也有RNA。但是，釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。 2.將DNA與蛋白質(zhì)分離：根據(jù)二者的特性，即在濃度較高的NaCl溶液（物質(zhì)的量濃度為2 mol/L）中，核蛋白容易解聚，游離出DNA。而DNA在 濃度較高的NaCl溶液中的溶解度很高，Na+與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鈉鹽。這時(shí)DNA在溶液中呈現(xiàn)溶解狀態(tài)。 3.DNA的析出與獲?。豪肈NA在濃度較低的NaCl溶液中溶解度小的原理，向含有DNA的濃度較高的NaCl溶液中加入大量（300 mL）蒸餾水，稀釋NaCl溶液，使DNA的溶解度下降，而蛋白質(zhì)的溶解度增高（這就是蛋白質(zhì)的鹽溶現(xiàn)象），從而使二者分離。這時(shí)，加上不停地?cái)嚢瑁芙舛认陆档腄NA逐漸呈絲狀物。再通過過濾，濾去蛋白質(zhì)，就可以獲取DNA的黏稠物了。如果采用離心法則更好，用4000 r/min 的旋轉(zhuǎn)頻率，離心15 min ，除去上清液（含有蛋白質(zhì)），留下的沉淀物中含DNA。 4.DNA的再溶解：再用較高濃度的NaCl溶液去溶解DNA黏稠物。 5.DNA的沉淀和濃縮：除去了蛋白質(zhì)的核酸溶液，必須再進(jìn)一步沉淀和濃縮。最常用的方法是酒精沉淀法。就是將含有Na+的DNA溶液，加入到相當(dāng)于其兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%冷酒精溶液中，混勻以后可以使DNA沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物，懸浮于溶液中。如果出現(xiàn)的絲狀物較少，可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮后的DNA絲狀物，可以用緩緩旋轉(zhuǎn)玻璃棒的方法卷起（因?yàn)椴ＡО粲形紻NA的作用）。 6.DNA的鑒定：本實(shí)驗(yàn)中鑒定DNA的方法為二苯胺法。二苯胺法的原理是：DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成w—羥基—r酮基戊醛，它再和二苯胺作用而顯現(xiàn)藍(lán)色（溶液呈淺藍(lán)色）。 鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。 三、鑒定DNA的其他方法 用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。 1.配制染色劑。用蒸餾水配制萬分之五的溴化乙錠（EB）溶液。 2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹于蠟紙上，再滴一滴EB溶液染色。 3.將蠟紙放在紫外燈（260 nm）下照射（暗室中），可見橙紅色的螢光（DNA的紫外吸收高峰在280 nm處）。 四、DNA粗提取與鑒定的另一種方法 1.材料用具 新鮮菜花（或蒜黃、菠菜）。 塑料燒杯，量筒，玻璃棒，尼龍紗布，陶瓷研缽，試管，試管架，試管夾，漏斗，酒精燈，石棉網(wǎng)，三角架，火柴，刀片，天平。 研磨液，體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液，二苯胺試劑，蒸餾水。 2.方法步驟 A.DNA的粗提取 （1）準(zhǔn)備材料：將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室，至少24小時(shí)。 （2）取材：稱取30 g菜花，去梗取花，切碎。 （3）研磨：將碎菜花放入研缽中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。 （4）過濾：在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液濾入燒杯中（有條件的學(xué)校可將濾液倒入塑料離心管中進(jìn)行離心，用1000 r/min 的旋轉(zhuǎn)頻率，離心2~5 min；取上清液放入燒杯中）。在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。 （5）加冷酒精：將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液中，并且玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液（玻璃棒不要直插燒杯底部）。沉淀3~5 min后，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。用玻璃棒緩緩旋轉(zhuǎn)，絮狀物會纏在玻璃棒上。 B.DNA的鑒定 （1）配制二苯胺試劑：取0.1 mL B液；滴入到10 mL A液中，混勻。 （2）鑒定：取4 mL DNA提取液放入試管中，加入4 mL二苯胺試劑，混勻后觀察溶液顏色（不變藍(lán)）。用沸水浴（100℃）加熱10 min。在加熱過程中，隨時(shí)注意試管中溶液顏色的變化（逐漸出現(xiàn)淺藍(lán)色）。 附1：研磨液的配制方法 Tris：10.1 g（相對分子質(zhì)量為121.4），先加50 mL蒸餾水溶解，用物質(zhì)的量濃度為2 mol/L的鹽酸調(diào)至pH=8.0，再加下述藥品。 NaCl：8.76 g（相對分子質(zhì)量58.44） EDTA：37.2 g（相對分子質(zhì)量372.24） SDS：20 g（相對分子質(zhì)量288.3） 待上述藥品全部溶解后，再用蒸餾水定溶至1000 mL。 若在室溫低于20℃時(shí)配制藥液，SDS呈沉淀析出，此時(shí)需要加溫，才能將SDS溶解。如果提前配制的研磨液出現(xiàn)了沉淀，則應(yīng)加溫使沉淀溶解后再使用。 附2：研磨液中幾種藥品的作用 SDS（十二烷基磺酸鈉）：可使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。 EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：為DNA酶的抑制劑，可以防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。 物質(zhì)的量濃度為0.15 mol/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。 Tris/HCl：提供緩沖體系，DNA在這個(gè)緩沖體系中呈穩(wěn)定狀態(tài)。（Tris為三羥甲基氨基甲烷） 五、典型例題分析 ［例1］關(guān)于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的敘述哪一個(gè)是正確的 A.隨著NaCl溶液濃度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大 B.隨著NaCl溶液濃度的減小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也減小 C.DNA在NaCl溶液中的溶解度與NaCl溶液的濃度無關(guān) D.當(dāng)NaCl溶液的濃度為0.14 mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低 分析：核酸在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度變化而改變的。在濃NaCl（1~2 mol/L）溶液中，DNA的溶解度很大，RNA的溶解度很小，在稀NaCl（0.14 mol/L）溶液中，DNA的溶解度很小，RNA溶解度很大，因此，可利用不同濃度NaCl溶液，將DNA和RNA從樣品中分別抽提出來。 答案：D ［例2］DNA的提取和鑒定實(shí)驗(yàn)中，提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)和析出含DNA的黏稠物這兩步中都用到了蒸餾水，其作用分別是 A.防止雞血細(xì)胞失水皺縮和稀釋NaCl溶液至0.14 mol/L B.防止雞血細(xì)胞失水皺縮和溶解DNA C.使雞血細(xì)胞吸水脹破和稀釋NaCl溶液至0.14 mol/L D.使雞血細(xì)胞吸水脹破和溶解DNA 分析：雞血細(xì)胞在清水中會吸水膨脹而最終脹破，從而釋放出核物質(zhì)。植物細(xì)胞由于有細(xì)胞壁的限制，不會因大量吸水而脹破。DNA在NaCl溶液中的溶解度；是隨著NaCl的濃度變化而改變的，在NaCl濃度為0.14 mol/L時(shí)，其溶解度最小，有利于DNA的析出。 答案：C ［例3］在“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中，將提取獲得的含DNA的黏稠物（還含有較多雜質(zhì)）分別處理如下： 第一，放入0.14 mol/L的氯化鈉溶液中，攪拌后過濾，得到濾液A和黏稠物a。 第二，放入2 mol/L的氯化鈉溶液中，攪拌后過濾，得濾液B和黏稠物b。 第三，放入冷卻的95%的酒精溶液中，攪拌后過濾，得濾液C和黏稠物c。 以上過程獲得的濾液和黏稠物中，因含DNA少而可以丟棄的是_____。 分析：在不同濃度的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度不同。在0.14 mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最??；DNA析出，呈絲狀物，過濾后存在于黏稠物中；在2 mol/L 的氯化鈉溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解狀態(tài)，過濾后存在于濾液中；酒精溶液可使DNA分子凝集，因此，在冷卻的95%的酒精溶液中DNA凝集，呈絲狀物，過濾后，存在于黏稠物中。 答案：A、b、C