高中生物《血紅蛋白的提取和分離》學案2新人教版選修

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1、 血紅蛋白的提取和分離 【課題目標】 本課題通過嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，使學生能夠體驗從復雜體系中提取 生物大分子的基本過程和方法， 并了解色譜法、 電泳法等分離生物大分子的基本原理， 為今 后學習運用這些技術打下基礎。 【課題重點與難點】 課題重點：凝膠色譜法的原理和方法。 課題難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。 【導學誘思】 1．凝膠色譜法 凝膠色譜法也稱做 ，是根據 分離蛋白質的有效方法。 凝膠實際上是一些由 構成的多

2、孔球體， 在小球體內部有許多貫穿的通道， 相 對分子質量不同的蛋白質分子通過凝膠時速度不同，相對分子質量較小的蛋白質 進 入凝膠內部的通道，路程 ，移動速度 ；而相對分子質量 的蛋白質 無法進入凝膠內部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 。 相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。 2．緩沖溶液 緩沖溶液的作用是 。 緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。 生物體內進行的各種生物化學 反應都是在一定的 pH 下進行的，例如：血漿的 pH 是 ，要在實驗條件下準確 模擬生物體內的過程，必須保持體外的 pH 與體內的基本一致。 3．

3、電泳 電泳是指 。許多重要的生物大分子， 如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的 pH 下，這些基團會帶上 。在 電場的作用下， 這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動。 電泳利用了待分離 樣品中各分子 以及分子本身的 、 的不同， 使帶電分子產生 不同的 ，從而實現樣品中各種分子的分離。 兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質分子 量時通常使用 。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移 率取決于 以及 等因素。 4．蛋白質的提取和分離 蛋白質的提取和分離一般分為四步： 、 、 和 。 5．樣品處理 血液由 和 組成，其

4、中紅細胞最多。紅細胞具有 的特點。紅細胞中有一種非常重要的蛋白質 ，其作用是 ，血紅蛋白有 個肽鏈組成， 包括 ，其中每條肽 用心 愛心 專心 1 鏈環(huán)繞一個 ，磁基團可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現紅 色。 紅細胞的洗滌 洗滌紅細胞的目的是 ，采 集的血樣要及時采用 分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ， 將下層暗紅色的 倒入燒杯， 再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時 間離心，如此重復洗滌三次，直至 ，表明紅細胞已洗滌干凈。 血紅蛋白的釋放 在

5、 和 作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4 層。第一層 為無色透明的 ，第 2 層為白色薄層固體， 是 ，第 3 層是紅色透明液體， 這是 ，第 4 層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除 去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 透析 取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入 中，將透析袋放入盛有 300mL 的物質的量 的濃度為 20mmol/L 的 中，透析 12h 。透析可以去除樣品中 的雜質， 或用于更換樣品的 。

6、 6．凝膠色譜操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因為 ，所以裝 柱前需要根據色譜柱的內體積計算所需要的凝膠量。 在裝填凝膠柱時， 不得有 存在。 因為氣泡會 ，降低分離效果。第三步是 。 【疑難點撥】 1． 凝膠色譜法分離蛋白質的原理 凝膠色譜法也稱為分配色譜法， 它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一。 所用的 凝膠實際上是一些微小的多孔球體， 這些小球體大多數是由多糖類化合物構成， 小球體內部 有許多貫穿的通道， 當一個含有各種分子的樣品

7、溶液緩慢流經時， 各分子在色譜柱內進行兩 種不同的運動， 即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動， 相對分子質量較大的蛋白質分子不 能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間， 通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質 量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此， 樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出， 相對分子質量中等的分子后流出， 相對分子質量 最小的分子最后流出，這種現象又叫分子篩現象。 此外， 凝膠本身具有三維網狀結構， 相對 分子質量大的分子通過這種網狀結構上的空襲時阻力大， 而相對分子質量小的分子通過時阻 力小，因此不同

8、分子量的蛋白質分子可以獲得分離。 2．與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義 哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀， 沒有細胞核和細胞器。 其含有的血紅蛋 白是有色蛋白， 因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。 這 使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 3．電泳的作用及其原理 電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物大分子， 如氨基酸、 多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的

9、pH 下會帶上正電或 負電； 在電場的作用下， 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。 電泳技術 就是在電場的作用下， 利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、 形狀等性質 的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。 【典例解析】 用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質（ D ） 用心 愛心 專心 2 A 路程較長，移動速度較慢 B 路程較長，移動速度較快 C 路程較短，移動速度較慢 D 路程較短，移動速度較快 解析： 在小球體內部有許多貫穿

10、的通道， 當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時， 相對分 子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道， 路程較長， 移動速度較慢； 而相對分子質量 較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。 【課本問題答案和提示】 （一）旁欄思考題 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？ 答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內部有許多貫穿的通道。相對分子質 量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部， 只能分布在顆粒之間， 通過的路程較短， 移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白

11、質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長， 移動速度較慢。 因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出， 相對分子質量中等的分子后流出，相對分子質量最小的分子最后流出， 從而使各種相對分子質量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、 均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙， 使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。 （二）練習 1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法， 它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一。 所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體， 這些小球體大多數是由多糖類化合物構成， 小球 體內部有許

12、多貫穿的通道， 當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時， 各分子在色譜柱內 進行兩種不同的運動， 即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動。 相對分子質量較大的蛋白質 分子不能進入凝膠顆粒內部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短， 移動速度較快； 相對 分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。 因此， 樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出， 相對分子質量中等的分子后流出， 相對分 子質量最小的分子最后流出， 這種現象又叫分子篩現象。 此外，凝膠本身具有三維網狀結構， 相對分子質量大的分子通過這種網狀結構上的空隙時阻力大，

13、 而相對分子質量小的分子通過 時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得分離。 2．答：在一定范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液 pH 發(fā)生明 顯變化的作用叫做緩沖作用， 具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液通常是由一或兩 種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 pH 范圍的緩沖液。 緩沖溶液的作用是維持反應體系的 pH 不變。在生物體內進行的各種生物化學過程都是 在精確的 pH 下進行的，受到氫離子濃度的嚴格調控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物 體內的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學反應過

14、程有與體內過程完全相同的 pH。 3．答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子， 如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的 pH 下會 用心 愛心 專心 3 帶上正電或負電； 在電場的作用下， 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。 電泳技術就是在電場的作用下， 利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、 形狀等性質的差異， 使帶電分子產生不同的遷移速度， 從而達到對樣品進行分離、 鑒定或提純的目的。 4．答：血紅蛋白提

15、取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和 純度鑒定。 首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液， 即樣 品的處理； 再經過透析去除分子量較小的雜質， 即樣品的粗分離； 然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 參考資料 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度 1．試劑的配制 （

16、1）丙烯酰胺和 N, N- 甲叉雙丙烯酰胺 用去離子水配制 29%（29 g/100 mL ，下同） 的丙烯酰胺和 1%的 N, N- 甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。 由于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中會分別緩慢轉變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一反應是由光或堿催化的。因此在每次使用前，應核實溶液的 pH 不超過 7.0 ；并且應將配制好的溶液置于棕色瓶中，室溫貯存，每隔幾個月須重新配制。 （2）十二烷基硫酸鈉（ SDS） 用去離子水配成 10%的貯存液，于室溫保存。 （3）用于制備分離膠和濃縮膠的 Tris 緩沖液 1.5 mol/L 、pH8.8 的 Tris 緩沖液（分離膠

17、緩沖液）； 1 mol/L 、 pH6.8 的 Tris 緩沖液（濃縮膠緩沖液）。 （ 4）TEMED(N,N,N′,N′ - 四甲基乙二胺 ) TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。 （ 5）過硫酸銨 用去離子水配制 10%的過硫酸銨溶液。 過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。 （ 6）Tris —甘氨酸電泳緩沖液 25 mmol/L Tris ， 250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3) ， 0.1%的 SDS。 （ 7）樣品處理液50 mmol/L Tri

18、s — HCl(pH 6.8) ， 100 mmol/L DTT( 巰基蘇糖醇 ) 或 用 5%的巰基乙醇， 2%的 SDS，0.1%的溴酚藍， 10%的甘油。 （ 8）染色液0.1% 的考馬斯亮藍 R250， 40%的甲醇， 10%的冰醋酸。 用心 愛心 專心 4 （9）脫色液 10%的甲醇和 10%的冰醋酸。 由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經毒性，并且容易被皮膚吸收， 因此操作必須在通風櫥內或通風處進行。 TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞

19、作用，吞服可致命。因此在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟， 在老師的指導下完成。操作時要戴好一次性手套。 2．電泳 （1）根據廠家說明書安裝電泳用的玻璃板。 （2）配制 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液。用去離子水 4.6 mL ， 30%的丙烯酰 胺 2.7 mL， 1.5mol 、 pH 8.8 的 Tris 緩沖液 2.5 mL，10%的 SDS 0.1 mL， 10%的過硫酸胺 0.1 mL， TEMED 0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需 空間 ( 梳子的齒長再加 0.5 cm

20、)，再在膠液面上小心注入一層水（約高 2～3 mm），以阻止氧 氣進入凝膠溶液。 （3）分離膠聚合完全后（約 30 min ），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 （4）配制 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水 2.7 mL ， 30%的丙烯酰 胺 0.67 mL ， 1.0 mol 、 pH 6.8 的 Tris 緩沖液 0.5 mL ， 10%的 SDS0.041 mL，10%的過硫酸胺 0.04 mL ， TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液 中插入干凈的梳子。 整個操作過程

21、應注意避免氣泡的產生。 然后再補加濃縮膠溶液， 使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 （5）在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理。在電泳樣品中按 1∶1 體積比加入樣 品處理液，在 100 ℃溫度下加熱 3 min ，以使蛋白質變性。 （ 6）濃縮膠聚合完全后（ 30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入 Tris —甘氨酸電泳緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。 （ 7）按順序加樣，加樣量通常為 10～ 25 μ L。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后 ( 即進行凝膠色譜分離之前 ) 的樣品

22、和凝膠色譜分離之后的樣品。 （8）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為 8 V/cm 。當染料前沿進入分離膠后， 把電壓提高到 15 V/cm ，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約 1 cm 處，關閉電源。 （ 9）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標注凝膠的方位。 （ 10）將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍染色液中染色 1～ 2 h。換脫色液脫色 3～10 h，其 間需多次更換脫色液至背景清楚。 脫色后， 可將凝膠浸于水中， 長期封裝在塑料袋內使其不 會降低染色強度。為保存永久性記錄，可

23、對凝膠進行拍照，或將凝膠干燥成膠片。 通過本實 驗的電泳圖譜，可以看見提取的血紅蛋白的純度并不是很高。 用心 愛心 專心 5 【教學反思】 用心 愛心 專心 6