生物：53《血紅蛋白的提取和分離》課件（新人教版選修1）

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1、血紅蛋白含有四條肽鏈血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵亞鐵血紅素基團(tuán)，血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而呈而呈紅色。紅色。課題課題3 3 血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離專題專題5 DNA5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí): :學(xué)生活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)1:1:1 1 、分離生物大分子的基本思路是什么？、分離生物大分子的基本思路是什么？2 2 、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3 3 、本課題我們將利用血紅蛋白與

2、雜質(zhì)蛋白哪、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？方面的差異進(jìn)行提純？4 4 、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？胞作為實(shí)驗(yàn)材料？5 5 、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)質(zhì) ？一、一、基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)-蛋白質(zhì)提取和分離原理蛋白質(zhì)提取和分離原理 蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別。親和力等千差萬(wàn)別。 提取提取分離分離方

3、法方法凝膠色譜法凝膠色譜法 凝膠電泳法凝膠電泳法 （1 1）原理：）原理：（2 2）材料）材料大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；大分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。小分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 (一一)凝膠色譜法凝膠色譜法（3 3）分離過(guò)程）分離過(guò)程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脫脫大分子流動(dòng)快大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢小分子流動(dòng)慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，洗脫：從色譜柱上端不斷注

4、入緩沖液， 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 (一一)凝膠色譜法凝膠色譜法(一一)凝膠色譜法凝膠色譜法 凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）： 1 1、什么是凝膠？、什么是凝膠？ 2 2、什么是凝膠色譜法？、什么是凝膠色譜法？學(xué)生活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)2:2:3、凝膠色譜法的原理是什么？、凝膠色譜法的原理是什么？4、請(qǐng)用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離、請(qǐng)用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過(guò)程。相對(duì)分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過(guò)程。1 1 、什么是緩沖液？、什么是緩沖液？2 2、 緩沖液的作用是什么？緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)3:3:3 3、

5、緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過(guò)的人體緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過(guò)的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些？血液的緩沖物質(zhì)有哪些？4 4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？加緩沖液？（二）、緩沖溶液（二）、緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸，醋酸/ /醋酸鈉，醋酸鈉，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等緩沖溶液洗脫劑緩沖溶液洗脫劑組成：組成：配制：配制：作用：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pHpH的緩沖液。的

6、緩沖液。抵制外界酸堿對(duì)溶液抵制外界酸堿對(duì)溶液pHpH的干擾而保持的干擾而保持 pHpH穩(wěn)定。穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液（二）、緩沖溶液1 1 、什么是電泳？、什么是電泳？2 2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些？影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)4:4:4 4、電泳分離各種分子的原理是什么？、電泳分離各種分子的原理是什么？（三）、電泳（三）、電泳3 3、 如何消除電荷對(duì)電泳遷移速度的影響？如何消除電荷對(duì)電泳遷移速度的影響？5 5 、請(qǐng)描述電泳的過(guò)程？、請(qǐng)描述電泳的過(guò)程？2 2凝膠電泳法：凝膠電泳法：（1 1）原理：）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、

7、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。同。 影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素(三三)電泳電泳1.1.電泳的概念電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程. .影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素決定決定運(yùn)動(dòng)方運(yùn)動(dòng)方向向形成形成庫(kù)侖力庫(kù)侖力形成形成阻力阻力決定決定運(yùn)動(dòng)速運(yùn)動(dòng)速率率電荷性電荷性質(zhì)質(zhì)電荷量電荷量分子形分子形狀狀分子大小在一定在一定pHpH下

8、，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的加入帶負(fù)電荷多的SDSSDS，形成，形成“蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)復(fù)合物合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 （2 2）分離方法：）分離方法：（3 3）分離過(guò)程：）分離過(guò)程： 瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(三三)電泳電泳電泳檢測(cè)結(jié)果電泳檢測(cè)結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1 1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集

9、到紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。的血紅蛋白溶液。（2 2）粗分離：透析除去分子較小的雜）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。質(zhì)。（3 3）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量）純化：通過(guò)凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4 4）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠）純度鑒定：通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。電泳鑒定。（一）樣品處理（一）樣品處理 1 1、紅細(xì)胞的洗滌：、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。黃色血漿；

10、用生理鹽水洗滌。 2 2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放 3 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。液漏斗分出紅色透明液體。 4 4、透析：、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PHPH為為7.07.0）透析。）透析。樣品處理樣品處理粗粗 分分 離離純純 化化純度鑒定純度鑒定 血液組成血液組成成分成分 1.洗洗 滌滌 紅紅 細(xì)細(xì) 胞胞 2.釋放釋放血紅蛋白血紅蛋白 3.分離分離血紅蛋白

11、血紅蛋白 4.透析透析血紅蛋白血紅蛋白二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作血液組成成分血液組成成分閱讀思考：閱讀思考：1.1. 血液由血液由_ _ 和和_兩部分組成。兩部分組成。2.2. 血細(xì)胞中血細(xì)胞中_細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是量最高的有機(jī)化合物是_。3.3. 該化合物是由該化合物是由 _ _和和_構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O O2 2和和COCO2 2結(jié)合的結(jié)合的_基團(tuán)?；鶊F(tuán)。血漿血漿血細(xì)胞血細(xì)胞紅細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白血紅蛋白2條條-肽鏈肽鏈2條條-肽鏈肽鏈 亞鐵血紅素亞鐵血紅素返回返回1.1.洗洗 滌滌 紅紅 細(xì)

12、細(xì) 胞胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過(guò)程：洗滌過(guò)程：血液血液100mL100mL3g3g檸檬酸鈉檸檬酸鈉低速離心低速離心2 min2 min紅細(xì)胞紅細(xì)胞血血 漿漿吸出血漿吸出血漿紅細(xì)胞紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水倍體積生理鹽水?dāng)嚢钄嚢?0min重復(fù)洗滌重復(fù)洗滌3 3次，直至上清液沒(méi)有黃色次，直至上清液沒(méi)有黃色采集得到雞血初次離心后的結(jié)果初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果返回返回2.2.釋放血紅蛋白釋放血紅蛋白閱讀思考：閱讀思考：1. 釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？哪些物質(zhì)？2. 為了加速釋放過(guò)程，采取了什么

13、措施？為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：蒸餾水的作用是蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖浅浞謹(jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂加速紅細(xì)胞的破裂 加蒸餾水到原血液體積，再加加蒸餾水到原血液體積，再加4040體積的甲苯體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)?，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢璋?010分鐘（加速細(xì)胞破裂）分鐘（加速細(xì)胞破裂）, ,細(xì)胞破裂釋放出細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。血紅蛋白。磁力攪拌器返回返回3.3.分離血紅蛋白分離血紅蛋白分離過(guò)程分離過(guò)程紅細(xì)胞紅細(xì)胞混合液混合液

14、高速離心高速離心10min 離心離心管管濾紙濾紙過(guò)濾過(guò)濾脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)燒杯燒杯將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以內(nèi)，以2000r/min2000r/min的速度離心的速度離心10 min10 min。第第1 1層（最上層）：甲苯層層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第（無(wú)色透明）；第2 2層（中上層）：脂溶性層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3 3層（中層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第液體）；第4 4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。（暗紅色）

15、。用濾紙過(guò)濾，除去用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。分出下層的紅色透明液體。4.4.透析血紅蛋白透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液1mL1mL利用透析袋透析透析過(guò)程透析過(guò)程純化凝膠色譜操作純化凝膠色譜操作1.1.凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的制作制作：2.2.凝膠色譜柱的凝膠色譜柱的裝填裝填：教材圖教材圖5193.3.樣品的樣品的加入和洗脫加入和洗脫（二）凝膠色譜操作（二）凝膠色譜操作取長(zhǎng)取長(zhǎng)4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘厘米的玻璃管，米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。兩端需用砂紙磨平。底塞的制作

16、：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100100目目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：。組裝：將上述三將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。裝配好的凝膠柱返回材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠材

17、料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液裝填裝填: :2.2.凝膠色譜柱的裝填：凝膠色譜柱的裝填：步驟步驟操作要求操作要求立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液裝填懸浮液凝膠顆粒洗脫液凝膠顆粒洗脫液沸水浴沸水浴 凝膠顆粒蒸餾水凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液配制懸浮液計(jì)算稱量凝膠計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱固定色譜柱A A、材料：、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚

18、糖凝膠（G-75G-75）。）。B B、代表意義代表意義：“G G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍圍。7575表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。配制凝膠懸浮液：配制凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。液。A A、固定：、固定：將色譜柱裝置固定在將色譜柱裝置固定在支架上。支架上。B B、裝填：、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)

19、輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：注意：1 1、凝膠、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2 2、裝填、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝填完畢后，裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸緩磷酸緩沖液（沖液（pHpH為為7.07.0）充分洗滌充分洗滌

20、平衡平衡1212小時(shí)小時(shí)。1 1、洗、洗脫液面不要低于凝膠表面，脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離終生物大分子物質(zhì)的分離效果。效果。2 2、不能發(fā)生洗脫液、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象象。打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的頂端，樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣

21、，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。不要破壞凝膠面。 加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸緩沖液到的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每集流出液，每5ml5ml收集一試管，連續(xù)收集收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，。（在分離過(guò)程中

22、，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）正確的加樣操作：正確的加樣操作：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。3.3.樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫正確的加樣操作是：正確的加樣操作是：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。2 2、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。收集得到的純化后的血紅蛋白收集得到的純化后的血紅蛋白注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1. 1. 紅細(xì)胞的洗滌：紅細(xì)胞的

23、洗滌： 洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。洗滌次數(shù)不能過(guò)少；低速、短時(shí)離心。2. 2. 凝膠的預(yù)處理：凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3. 3. 色譜柱的裝填：色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無(wú)氣泡；洗脫液不能斷流。液不能斷流。4. 4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。為什么？為什么？觀察你處理的血液樣品離心后觀察你處理的血液樣品離心后是否分層是否分層（見(jiàn)（見(jiàn)教科書(shū)圖教科書(shū)圖5-185-18），），如果分層不明顯，可能是洗如果分層不明顯，

24、可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。后續(xù)血紅蛋白的提取純度。1 1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2 2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

25、 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖20002000或紅色葡聚糖，或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要

26、重新裝柱。除不了時(shí)要重新裝柱。 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。知識(shí)總結(jié)知識(shí)總結(jié)血血紅紅蛋蛋白白的的提提取取和和分分離離蛋白質(zhì)分子的差異性蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法凝膠色譜法原原 理理分離過(guò)程分離過(guò)程凝膠電泳法凝膠電泳法緩沖溶液緩沖溶液組組 成成

27、作作 用用蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的提取分離提取分離樣品處理樣品處理粗粗 分分 離離純純 化化純度鑒定純度鑒定教學(xué)反饋教學(xué)反饋 1凝膠色譜法是根據(jù)（凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小分子的大小B相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少帶電荷的多少D溶解度溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)維持（維持（）基本不變。）基本不變。A溫度溫度BpHC滲透壓滲透壓D氧氣濃度氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。）的電極

28、移動(dòng)。A相同相同B相反相反C相對(duì)相對(duì)D相向相向4.哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白血紅蛋白B肌紅蛋白肌紅蛋白C肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)蛋白D肌球蛋白肌球蛋白BBBA5 5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。的含量最多。 A A白細(xì)胞白細(xì)胞 B B血小板血小板 C C紅細(xì)胞紅細(xì)胞 D D淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞6 6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)獎(jiǎng)?）。）。 A. NaCl B. A. NaCl B.甲苯甲苯 C.C.蒸餾水

29、蒸餾水 D.D.檸檬酸鈉檸檬酸鈉7 7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為可以明顯看到試管中的溶液分為4 4層，其中第層，其中第3 3層是（層是（ ） A A無(wú)色透明的甲苯層無(wú)色透明的甲苯層 B B脂溶性物質(zhì)的沉淀層脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C C血紅蛋白的水溶液血紅蛋白的水溶液 D D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固1 1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是的一步是A A 弄清各種蛋白質(zhì)

30、的空間結(jié)構(gòu)弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B B 弄清各種蛋白質(zhì)的功能弄清各種蛋白質(zhì)的功能C C 弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程D D 獲得高純度的蛋白質(zhì)獲得高純度的蛋白質(zhì)2 2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A A 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B B 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C C 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量

31、較小的蛋白質(zhì)行程等于相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D D 二者根本無(wú)法比較二者根本無(wú)法比較3 3、使用、使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A A 電荷的多少電荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽鏈的多少肽鏈的多少 D D 分子形狀的差異分子形狀的差異4 4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A A 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH B pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C C 防止微生物生長(zhǎng)防止微生物生長(zhǎng) D D 防止血液凝固防止血液凝固5 5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O O2 2分子數(shù)分子數(shù)和和COCO2 2分子數(shù)分別是分子數(shù)分別是A 4A 4、2 B 42 B 4、4 4 C 2C 2、1 D1 D、1 1、1 16 6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序分層順序自上而下自上而下是：是：有有機(jī)溶劑機(jī)溶劑-脂脂類物質(zhì)類物質(zhì)-血血紅蛋白溶液紅蛋白溶液-紅紅細(xì)胞破碎物沉淀細(xì)胞破碎物沉淀