大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化ppt課件

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實(shí)驗(yàn)二 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 1 內(nèi)容一 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器 材料 試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 1 2 3 4 注意事項(xiàng) 思考題 5 6 2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握感受態(tài)細(xì)胞的概念及其意義 掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備原理與操作方法 3 實(shí)驗(yàn)原理 感受態(tài) 受體 或者宿主 最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài) 它是由受體菌的遺傳性狀所決定的 同時(shí)也受菌齡 外界環(huán)境因子的影響 制備感受態(tài)的細(xì)胞一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵 常用的感受態(tài)制備方法包括KCl CaCl2等方法 后者因?yàn)椴僮骱?jiǎn)便且符合大多數(shù)的分子克隆要求 因而被廣泛采用 4 CaCl2法的基本原理 細(xì)菌處于低溫 0 和低滲的CaCl2溶液中 菌體膨脹 細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變 轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基 鈣磷酸復(fù)合物黏附于菌體表面 在42 進(jìn)行短時(shí)間的熱激處理 促進(jìn)DNA的吸收 實(shí)驗(yàn)原理 5 CaCl2法簡(jiǎn)便易行 用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞 可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5 106 2 107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落 在實(shí)際工作中 每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實(shí)驗(yàn) 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí) 加入占總體積15 的無(wú)菌甘油于 70 可以保存半年 實(shí)驗(yàn)原理 6 提高轉(zhuǎn)化效率要考慮幾個(gè)重要因素 實(shí)驗(yàn)原理 1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4 的培養(yǎng)菌 最好從 70 或 20 甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好 可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600來(lái)控制 DH5 菌株的OD600為0 5時(shí) 細(xì)胞密度在5 107個(gè) ml左右 7 2 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA 轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí) 轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低 1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50 l的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和 一般情況下 DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5 實(shí)驗(yàn)原理 8 3 試劑的質(zhì)量 所用的試劑 如CaCl2等均需是最高純度的 并用超純水配制 并用微孔濾膜過(guò)濾滅菌 最好分裝保存于干燥的冷暗處 實(shí)驗(yàn)原理 9 4 防止雜菌和雜DNA的污染 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 所用器皿 如離心管 tip頭等最好是新的 并經(jīng)高壓滅菌處理 所有的試劑都要滅菌 且注意防止被其它試劑 DNA酶或雜DNA所污染 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入 為以后的篩選 鑒定帶來(lái)不必要的麻煩 實(shí)驗(yàn)原理 10 實(shí)驗(yàn)儀器 材料 試劑 1 儀器 高壓滅菌鍋 恒溫水浴鍋 臺(tái)式離心機(jī) 無(wú)菌操作臺(tái) 微量移液器 恒溫?fù)u床 2 材料 菌種E coliDH5 3 試劑 LB液體培養(yǎng)基 0 1MCaCl2 11 1 將E coliDH5 單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中 37 震蕩培養(yǎng)過(guò)夜 2 取30 l液體培養(yǎng)液加入3mlLB液體培養(yǎng)基中 37 下震蕩培養(yǎng) 至光密度值OD600在0 5 0 6之間 5 107個(gè) ml 3 取1mlE coli液體培養(yǎng)液于1 5ml的離心管中 4000rpm 4 離心3min 實(shí)驗(yàn)步驟 12 4 快速的吸除上清 向沉淀中加入1ml冰冷的0 1MCaCl2溶液 使沉淀充分懸浮 動(dòng)作要輕柔 置于冰上30min 4000rpm 4 離心3min 5 棄上清 加入lml凍存液 含15 甘油的0 1MCaCl2溶液 溶液 使沉淀充分懸浮 以每管0 1ml的規(guī)格分裝3管 凍存于 80 可保存4 6個(gè)月 實(shí)驗(yàn)步驟 13 注意事項(xiàng) 1 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)存與4 的培養(yǎng)菌 最好從 80 甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液 2 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為宜 可以通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600控制 DH5 菌株的OD600為0 5時(shí) 細(xì)胞密度比較合適 密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率 14 注意事項(xiàng) 3 進(jìn)行熱激制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)要控制好時(shí)間 4 懸浮細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔 以免造成菌體破裂 影響轉(zhuǎn)化 15 思考題 1 影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些 16 內(nèi)容二 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器 材料 試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 1 2 3 4 注意事項(xiàng) 思考題 5 6 17 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義 學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞及篩選重組子的方法 18 實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化 指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞 并使其生物學(xué)特性發(fā)生可遺傳的變化的過(guò)程 是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù) 19 轉(zhuǎn)化的方法 1 化學(xué)的方法 熱激法 使用化學(xué)試劑 如CaCl2 制備的感受態(tài)細(xì)胞 通過(guò)熱激處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 2 電轉(zhuǎn)化法 使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞 通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)原理 20 用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞使其處于感受態(tài)后 通過(guò)熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌中 進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)粒能夠自主復(fù)制并在宿主中實(shí)現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄 表達(dá) 實(shí)驗(yàn)原理 21 實(shí)驗(yàn)原理 22 轉(zhuǎn)化體的篩選方法 主要用不同抗生素基因篩選 常用的抗生素有 氨芐青霉素 卡那霉素 氯霉素 四環(huán)素 鏈霉素等 實(shí)驗(yàn)原理 23 如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無(wú)選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上 會(huì)出現(xiàn)成千上萬(wàn)的細(xì)菌菌落 將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng) 才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體 即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)原理 24 本實(shí)驗(yàn)使用的pGEX 4T 2質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因 Amp 理論上只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基生長(zhǎng) 但抗性篩選只是初步的篩選 可能仍有部分未轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)菌能在抗性培養(yǎng)基上生存 假陽(yáng)性 因此還需要通過(guò)提取質(zhì)粒酶切 電泳作進(jìn)一步的鑒定 實(shí)驗(yàn)原理 25 實(shí)驗(yàn)儀器 材料 試劑 1 儀器 恒溫?fù)u床 恒溫水浴鍋 電熱恒溫培養(yǎng)箱 無(wú)菌工作臺(tái) 微量移液槍 2 材料 DH5 感受態(tài)細(xì)胞 質(zhì)粒pGEX 4T23 試劑 LB液體及固體培養(yǎng)基 氨芐青霉素Amp 50mg ml 26 實(shí)驗(yàn)步驟 1 每100ul感受態(tài)細(xì)胞加入1ul質(zhì)粒DNA 同時(shí)做一個(gè)空白對(duì)照 由第一組完成 轉(zhuǎn)化體系100ul1ul 空白對(duì)照100ul1ul 感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒DNA蒸餾水 27 2 輕輕混勻 立即放在冰上30min 3 42 水浴90s 然后迅速冰浴1 2min 4 加入0 8mlLB液體培養(yǎng)基 160r min 37 培養(yǎng)40min 5 稀釋后 取培養(yǎng)液100ul 涂布于含有50ug mlAmp的平板上 直至液體被培養(yǎng)基全部吸收 6 平板倒置 37 過(guò)夜培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)步驟 28