人教版高中生物選修1專題5課題3《血紅蛋白的提取和分離》導(dǎo)學(xué)案

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1、人教版高中生物選修1專題5課題3《血紅蛋白的提 取和分離》word導(dǎo)學(xué)案 一、基礎(chǔ)知識(shí) （一）凝膠色譜法 1、凝膠色譜法也稱做,是依照分離蛋白質(zhì)的有效方 法。 2、凝膠實(shí)際上是一些微小的—球體，這些小球體大多數(shù)是由構(gòu)成的，如偏 聚糖或瓊脂糖。 3、在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量—的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程—，移動(dòng)速度—：而相對(duì)分子質(zhì)量—的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動(dòng)，路程—，移動(dòng)速 度—o相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 （~）緩沖溶液 1、緩沖溶液的作用是 2、緩沖溶液通常由溶

2、解于水中配制而成的。 3、生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)差不多上在一定的pH下進(jìn)行的，為了 ，必須保持體外,的pH與體內(nèi)的。 （三）電泳 1、電泳是指o 2、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上一 一o在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷—的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子的差異以及分子本身的—、的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同 的,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 3、兩種常用的電泳方法是和，在凝膠中加入SDS,電泳速率完 全取決于— ，因此，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)通常使用. 二、實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一樣

3、分為四步：、、和o （-）樣品處理 1、紅細(xì)胞的洗滌：洗滌紅細(xì)胞的目的是,采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采納離心（500nmin）,然后用膠頭吸管吸出上層透亮 的，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為）,緩慢攪拌min, 離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至，講明紅細(xì)胞已洗滌潔凈。 2、血紅蛋白的開釋：在和作用下，紅細(xì)胞破裂開釋出血紅蛋白。 ，第4層是的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉 淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的o （二）粗分離：透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為 20mmol/L的 （

4、PH7.0）中，透析12h,透析能夠去除樣品中的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。 （三）純化：凝膠色譜操作 L、制作凝膠色譜柱 2、裝填凝膠色譜柱 ①裝填前將色譜柱固定在支架上。因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平穩(wěn)好的凝膠的體 積，因此裝柱前需要依照色譜柱的內(nèi)體積運(yùn)算所需要的凝膠量。 ②裝填時(shí)凝膠要緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)要輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠裝 填，色譜柱內(nèi)不得有存在，一旦發(fā)覺，必須重裝。 ③裝填完后，連接緩沖液洗脫瓶，在約50cm高的操作壓下，用300mL物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的。（PH7.0）充分洗滌平穩(wěn)凝膠12h,使凝膠。 3、樣品的加入和洗脫 ①預(yù)備：打開色譜柱下端

5、的流出口，使柱內(nèi)凝膠而上的的緩沖液與凝膠面，關(guān)閉出口。 ②加樣：用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意。加樣后打開下端出口，直到樣品后，關(guān)閉下端出口。 ③洗脫：小心加入物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的（PH7.0）到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。待接近色譜柱時(shí)，用試管收 集。 （四）純度鑒定： 三、操作提示 1、紅細(xì)胞的洗滌洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)刻十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去:離心速度過(guò)高和時(shí)刻過(guò)長(zhǎng)會(huì)使一同沉淀，達(dá)不到分離的成效。 2、色譜柱填料的處理商品凝膠使干燥的顆粒，使用前需直截了當(dāng)放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，能夠?qū)⒓尤胂疵?/p>

6、液的濕凝膠用加熱，逐步升溫至接近沸騰，通常只需 l-2ho這種方法不但,而且能夠除去凝膠中可能帶有的，排除膠粒內(nèi)的o 3、凝膠色譜柱的裝填在色譜柱中裝填凝膠的時(shí)候要盡量,以降低凝膠顆粒之間的間隙。在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì),降低。在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液—，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情形，凝膠色譜柱需要重新裝填。 4、蛋白質(zhì)的分離在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，認(rèn)真觀看紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情形。假如紅色區(qū)帶— 地移動(dòng)，講明色譜柱制作成功。 （-）旁欄摸索題 你能從凝膠色譜的分離原理分析什么緣故凝膠的裝填要緊密、平均嗎？ 答：凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，

7、小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快：相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。假如凝膠裝填得不夠緊密、平均，就會(huì)在色譜柱內(nèi),使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些間隙中通過(guò)，，阻礙分離的成效。 （二）練習(xí) 1.答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是依照分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球

8、體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí)，各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)，即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。相對(duì)分子質(zhì)量的 蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過(guò)的路程,移動(dòng)速度:相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路 程,移動(dòng)速度。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大「的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。2.答：在一定范疇內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶

9、液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由1?2緩沖劑溶解于水中制得，調(diào)劑緩沖劑的配比就可制得不同pH范疇的緩沖液, 緩沖溶液的作用是堅(jiān)持反應(yīng)體系的pH不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程差不多上在精確的pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下?就必須一 3 .答：電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如織基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核昔酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電：在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷的電極方向移動(dòng)。 電泳技術(shù)確實(shí)是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電以及分子本 身、等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn) 行、或的目的 4 .答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 ? 第一通過(guò)、、等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理； ? 再通過(guò)去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離： ? 然后通過(guò)將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化： ? 最后經(jīng)進(jìn)行純度鑒定。 5.答：血紅蛋白是蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)能夠通過(guò)觀看顏色來(lái)判定什么時(shí)候 應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅『蛋白的分離過(guò)程專門直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。