大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化ppt課件
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實驗八 大腸桿菌感受態(tài)細胞的 制備與轉化,1,實驗目的,1.了解轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。 2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法。 3.學習將外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞并篩選轉化體的方法。,2,實驗原理,轉化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系,使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術。,3,轉化中的受體細胞,轉化過程所用的受體細胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株,常用 RM 符號表示。,4,實驗原理,轉化方法:電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法 感受態(tài)細胞:的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生變化,成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。 轉化細胞(轉化子):帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。,5,實驗原理,本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞,用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài),然后與 pUC18質粒共保溫,實現轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因,因而使接受了該質粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性,用 Apr符號表示。將經過轉化后的全部受體細胞經過適應稀釋,在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),只有轉化體才能存活,而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。,6,,,,,,,抗Amp,,,宿主細菌,,,,,,,含Amp培養(yǎng)基,7,影響轉化率的因素,細胞生長狀態(tài)和密度。 轉化的質粒 DNA 的質量和濃度。 試劑的質量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。,8,實驗儀器,9,超凈工作臺,10,臺式高速冷凍離心機,11,恒溫空氣搖床,12,恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,13,實驗試劑,大腸桿菌DH5α LB培養(yǎng)基, 0.1mol/LCaCl2溶液(預冷) 氨芐青霉素 pUC18質粒,14,實驗步驟,菌株活化 感受態(tài)細胞制備 外源DNA的轉化,15,實驗步驟,菌株活化 用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α,在LB培養(yǎng)基平板表面劃線,于37℃培養(yǎng)16小時 挑取一個單菌落,轉到3-5ml LB培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)3-5小時 將培養(yǎng)液全部轉到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3小時,到OD600=0.3-0.4,16,實驗步驟,感受態(tài)細胞制備 將培養(yǎng)液轉入1.5ml離心管中,在冰上放置15-30min 4000rpm離心5min,棄上清 加入0.8ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀,冰上預冷10min 4000rpm離心5 min,棄上清 加入0.2ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀,即可使用。也可加入總體積15%的甘油 可-70℃長期保存,17,實驗步驟,轉化 取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中,于冰上放置30min 于42℃水浴90S 冰上放置2min 加入800μl LB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時 將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上 將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時,然后觀察結果,18,對照組,對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。,19,轉化率,統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數。 轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下: 轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/涂板菌液體積 轉化頻率(轉化子數/每mg質粒DNA)=轉化子總數/質粒DNA加入量(mg) 感受態(tài)細胞總數=對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/涂板菌液體積 感受態(tài)細胞轉化效率=轉化子總數/感受態(tài)細胞總數,20,,實驗結果,21,實驗報告,寫明實驗目的、實驗原理、儀器、材料與試劑 詳細列出實驗步驟; 畫出實驗結果的示意圖并做分析,計算轉化效率。,22,1. 在制備感受態(tài)細胞的實驗中要注意哪些 細節(jié)? 2. 影響感受態(tài)細胞轉化效率的因素有哪些?,思考題,23,- 配套講稿:
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