2019-2020年高中生物 5.3《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì) 新人教版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 5.3《血紅蛋白的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì) 新人教版選修1 教材內(nèi)容解讀 要點(diǎn)1　如何分離不同種類的蛋白質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異分離蛋白質(zhì)。如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等。 要點(diǎn)2　凝膠色譜柱 （1）定義 凝膠色譜法也稱作分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 （2）凝膠 所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成的，如葡聚糖或瓊脂糖。 （3）分離原理 在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)相對(duì)分于質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢；而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 要點(diǎn)3　 緩沖溶液 （1）緩沖溶液的緩沖作用 在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 （2）緩沖溶液的意義 生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進(jìn)行的，為了能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過(guò)程，就必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。 要點(diǎn)4　電泳 （1）定義 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 （2）電泳原理 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分于帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 （3）電泳過(guò)程中影響粒子運(yùn)動(dòng)快慢的因素 ①粒子帶電荷的多少。粒子帶電荷越多在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)越快。 ②粒子的質(zhì)量。粒子質(zhì)量越小在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)越快。 ③粒子的形狀。呈球形或近球形的粒子比鏈狀粒子運(yùn)動(dòng)快。 （4）荷質(zhì)比 粒子在電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)的快慢主要取決于電荷與質(zhì)量比，簡(jiǎn)稱荷質(zhì)比。荷質(zhì)比值越大的粒 子電泳時(shí)運(yùn)動(dòng)越快。 要點(diǎn)5　實(shí)驗(yàn)操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中紅細(xì)胞最多。在紅細(xì)胞的組成中，約90%是血紅蛋白。血紅蛋白由四個(gè)肽鏈組成，包括兩個(gè)-肽鏈和兩個(gè)-肽鏈 （1）樣品處理 ①紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的：去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化。 采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心，如500r／min離心2min，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。 ②血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細(xì)胞倒人燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min。 蒸餾水和甲苯作用：使紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 ③分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，以xxr／min的速度離心10min后，可以明顯看到試管中的液體分為4層。第1層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。 將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 ④透析 取lmL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋故人盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12h。 (2)凝膠色譜操作 ①凝膠色譜柱的制作 ②凝膠色譜柱的裝填將色譜柱垂直固定在支架上。計(jì)算所用凝膠量，并稱量。凝膠用 蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，在與色譜柱下端連接的尼龍臂打開(kāi)的情況下，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻。色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)有氣泡，必須重裝。裝填完后，立即連接緩沖液洗脫瓶，在約50cm高的操作壓下，用300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h，使凝膠裝填緊密。 ③樣品的加入和洗脫 打開(kāi)色譜柱下端的流出口。使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。用吸管小心地將lmL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，加樣時(shí)使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)，注意不要破壞凝膠面。加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。小心加入物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液(pH為7.0)到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口，進(jìn)行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。 ④注意事項(xiàng) 在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。 如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。 要點(diǎn)6　疑難解答 從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻? 凝膠色譜的分離時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分于只能從顆粒之間向下移動(dòng)，通過(guò)的路程較短，移動(dòng)速度較快，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢．因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。