2019-2020年高中生物 血紅蛋白的提取和分離備課教案 新人教版選修1.doc
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2019-2020年高中生物 血紅蛋白的提取和分離備課教案 新人教版選修1 教學(xué)目標(biāo): 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 教學(xué)重點(diǎn):凝膠色譜法的原理和方法 教學(xué)難點(diǎn):樣品的預(yù)處理;色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 教學(xué)過(guò)程: (一)引入新課 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,是細(xì)胞內(nèi)含量最高的有機(jī)化合物。對(duì)蛋白質(zhì)的研究有助于人們對(duì)生命過(guò)程的認(rèn)識(shí)和理解。所以需要從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢? (二)進(jìn)行新課 1.基礎(chǔ)知識(shí) 蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì):形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別,由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。 1.1凝膠色譜法(分配色譜法): (1)原理:(見課件圖) 分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙,路程短,流動(dòng)快;分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部,路程長(zhǎng),流動(dòng)慢。 (2)凝膠材料:多孔性,多糖類化合物,如葡聚糖、瓊脂糖。 (3)分離過(guò)程: 混合物上柱→洗脫→大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢→收集大分子→收集小分子 *洗脫:從色譜柱上端不斷注入緩沖液,促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。 1.2緩沖溶液 (1)原理:由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4等),調(diào)節(jié)酸和鹽的用量,可配制不同pH的緩沖液。 (2)緩沖液作用:抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。 1.3凝膠電泳法: (1)原理:不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同,在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同,導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。 [思考]閱讀投影補(bǔ)充材料后,填寫下表: 決定運(yùn)動(dòng)方向 形成庫(kù)侖力 形成阻力 決定運(yùn)動(dòng)速率 電荷性質(zhì) √ 電荷量 √ √ 分子形狀 √ √ 分子大小 √ √ (2)分離方法:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。 (3)分離過(guò)程:在一定pH下,使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電;加入帶負(fù)電荷多的SDS,形成“蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物”,使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2.1蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為哪些基本步驟? 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。 思考:是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都是這樣的?為什么? 不是。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的來(lái)源和性質(zhì)不同,分離方法差別很大。 2.2選擇實(shí)驗(yàn)材料 (1)你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動(dòng)物血液中,最好哪種血液來(lái)提取血紅蛋白?為什么? 哺乳動(dòng)物血液。因?yàn)樵摷?xì)胞中沒(méi)有細(xì)胞核,血紅蛋白含量高。 (2)請(qǐng)閱讀投影資料,認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考回答下列問(wèn)題: 血液由 和 兩部分組成。 血細(xì)胞中 細(xì)胞數(shù)量最多,細(xì)胞的含量最高的化合物是 。 該化合物是由 和 構(gòu)成的,其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的 基團(tuán)。 2.3從紅細(xì)胞中分離出血紅蛋白的過(guò)程為:洗滌紅細(xì)胞、釋放血紅蛋白、分離血紅蛋白、透析。洗滌紅細(xì)胞的目的是什么? 除去血漿蛋白的雜蛋白,有利于后續(xù)步驟的分離純化。 紅細(xì)胞的洗滌過(guò)程為 血液+檸檬酸鈉→低速短時(shí)離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞+5倍體積生理鹽水 →緩慢攪拌10min→低速短時(shí)離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無(wú)黃色 思考:加入檸檬酸鈉有何目的?為什么要低速、短時(shí)離心?為什么要緩慢攪拌? 防止血液凝固;防止白細(xì)胞沉淀;防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 思考:你有什么方法將紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來(lái)? 加入蒸餾水,用玻璃棒快速攪拌一段時(shí)間。 補(bǔ)充:加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜,有利于血紅蛋白的釋放和分離。此時(shí),紅細(xì)胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白,而且還含有細(xì)胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機(jī)溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢?由于它們的密度不同,科學(xué)家采取了離心分離的方法: 紅細(xì)胞破碎混合液→中速長(zhǎng)時(shí)離心(2000c/min10min)→濾紙過(guò)濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白 2.4如何除無(wú)機(jī)鹽離子和小分子有機(jī)物質(zhì)呢?。 透析。半透膜的選擇透過(guò)性,大分子物質(zhì)不能通過(guò)半透膜,離子和小分子能夠通過(guò)半透膜。 在透析過(guò)程中,血紅蛋白溶液中的離子和小分子不斷通過(guò)半透膜擴(kuò)散進(jìn)入到pH=7的磷酸緩沖液中。 思考:為何使用pH=7的磷酸緩沖液?為什么緩沖液量遠(yuǎn)多于血紅蛋白溶液量? 維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴(kuò)散。 總結(jié):通過(guò)以上四個(gè)基本過(guò)程,紅細(xì)胞中的血紅蛋白就被提取出來(lái)。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子(如呼吸酶等)。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白分離開來(lái)呢?我們來(lái)研究蛋白質(zhì)提取和分離的第二個(gè)步驟――粗分離(凝膠色譜操作)。 2.5凝膠色譜分離蛋白質(zhì)包括:制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品加入和洗脫。 根據(jù)教材圖5-19,說(shuō)出制作色譜柱需要的材料。 橡皮塞2個(gè)、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。 色譜柱的制作過(guò)程:準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱 下面進(jìn)行第二步――凝膠色譜柱的裝填。請(qǐng)閱讀教材: 色譜柱的裝填過(guò)程。 步驟 操作要求 ① 操作要求 色譜柱垂直固定在支架上 ② 計(jì)算稱量凝膠 根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量 ③ 配制懸浮液 凝膠顆粒+蒸餾水→充分溶脹 凝膠顆粒+洗脫液→沸水浴 ④ 裝填懸浮液 一次性緩慢倒入;輕輕敲打 ⑤ 緩沖液洗滌平衡 立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h 樣品加入和洗脫。其基本過(guò)程是: 調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì) 至此,血紅蛋白即可得到粗分離。在整個(gè)操作過(guò)程中,應(yīng)當(dāng)注意以下事項(xiàng): (1)紅細(xì)胞的洗滌:洗滌次數(shù)不能過(guò)少;低速、短時(shí)離心。 (2)凝膠的預(yù)處理:沸水浴法時(shí)間短,還能除去微生物和氣泡 (3)色譜柱的裝填:裝填盡量緊密,降低顆粒間隙;無(wú)氣泡;洗脫液不能斷流。 (4)色譜柱成功標(biāo)志:紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。 (三)課堂總結(jié)、點(diǎn)評(píng) 血 紅 蛋 白 的 取 和 分 離 凝膠色譜法 原 理 分離過(guò)程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 離 蛋白質(zhì)分子的差異性 蛋白質(zhì)分子的差異性 凝膠色譜法 原 理 分離過(guò)程 凝膠電泳法 凝膠色譜法 原 理 分離過(guò)程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 蛋白質(zhì)的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 (四)實(shí)例探究 例1 利用凝膠色譜法,什么樣的蛋白質(zhì)先洗脫出來(lái)( ) A.相對(duì)分子質(zhì)量大的 B.溶解度高的 C.相對(duì)分子量小的 D.所代電荷多的 解析:凝集色譜法使根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)能進(jìn)入凝膠內(nèi)部通道,路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢;相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì),路程較短,移動(dòng)速度較快,首先洗脫出來(lái)。 答案:A 例2 蛋白質(zhì)提取和分離分為哪幾步( ) A.樣品處理、凝膠色譜操作、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 B.樣品處理、凝膠色譜操作、純化 C.樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定 D.樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定 解析:蛋白質(zhì)的提取和分離分為樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定四步。A中凝膠色譜操作及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳為實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的技術(shù) 答案:C ☆綜合應(yīng)用 例3用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí),分子量大的蛋白質(zhì)( ) A路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢 B路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較快 C路程較短,移動(dòng)速度較慢 D路程較短,移動(dòng)速度較快 解析:在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,路程較長(zhǎng),移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,只能在凝膠外部移動(dòng),路程較短,移動(dòng)速度較快。 答案:D (五)鞏固練習(xí) 1. 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是( ) A. 對(duì)其他分子的親和力 B. 溶解度 C. 所帶電荷多少 D. 相對(duì)分子質(zhì)量的大小 2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是( ) A. 糖類化合物 B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì) D. 核酸 3. 選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料,有何好處( ) A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核 C. 紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高 D. 紅細(xì)胞DNA含量高 4. 將攪拌好的混合液離心來(lái)分離血紅蛋白溶液時(shí),第二層是( ) A. 甲苯 B. 血紅蛋白水溶液 C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D. 其他雜質(zhì)的沉淀 5. 血紅蛋白因含有( )而呈紅色 A. O2 B. CO C. CO2 D.血紅素 6. 下列操作正確的是( ) A. 分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長(zhǎng)時(shí)間離心 B. 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可 C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心 D. 透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液,透析12h 7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是( ) A. 先加入1ml透析后的樣品 B. 加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出 C. 如果紅色帶均勻一致的移動(dòng),說(shuō)明色譜柱制作成功 D. 洗脫時(shí)可以用緩沖液也可以用清水 8. 下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯(cuò)誤的是( ) A. 樣品的處理就是通過(guò)一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B. 通過(guò)透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì),此為樣品的粗提取 C. 可通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去,即樣品的純化 D. 可通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 9. 凝膠色譜法操作正確的是( ) A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴 B. 將橡皮塞下部切出凹穴 C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片 10. 樣品的加入和洗脫的操作不正確的是( ) A. 加樣前,打開色譜柱下端的流出口,使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面 B. 加樣后,打開下端出口,使樣品滲入凝膠床內(nèi) C. 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后,關(guān)閉下端出口 D. 用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端,不要破壞凝膠面 ★教后小記 本課題重在讓學(xué)生了解生物科學(xué)在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的進(jìn)展,說(shuō)明提取、分離高純度的蛋白質(zhì)的重要性和必要性,并學(xué)習(xí)一些蛋白質(zhì)分離和提取的基本技術(shù)??梢园l(fā)揮學(xué)生的主動(dòng)性,讓學(xué)生介紹當(dāng)前有關(guān)蛋白質(zhì)研究的新進(jìn)展,激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,然后指出本課題的學(xué)習(xí)意義,讓學(xué)生初步體會(huì)分離純化蛋白質(zhì)的過(guò)程和方法。- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來(lái)的問(wèn)題本站不予受理。
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