2019-2020年高中生物 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段備課教案 新人教版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段備課教案 新人教版選修1 教學(xué)目標(biāo)： （一）知識與技能 1、了解PCR技術(shù)的基本操作 2、理解PCR的原理 3、討論PCR的應(yīng)用 （二）過程與方法 在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段的實驗過程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴格控制溫度等反應(yīng)條件 （三）情感、態(tài)度與價值觀 通過對PCR實驗的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴謹?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實事求是的科研精神 教學(xué)重點：PCR的原理和PCR的基本操作 教學(xué)難點：PCR的原理 教學(xué)過程： （一）引入新課 在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴增技術(shù)――PCR技術(shù)。 （二）進行新課 1．基礎(chǔ)知識 PCR技術(shù)擴增DNA的過程，與細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似： 1．1細胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析： 條件 組分 作用 模板 DNA的兩條單鏈 提供復(fù)制的模板 原料 四種脫氧核苷酸 合成DNA子鏈的原料 酶 解旋酶 DNA聚合酶 打開DNA雙螺旋 催化合成DNA子鏈 能量 ATP 為解螺旋和合成子鏈供能 引物 RNA 為DNA聚合酶提供合成的3’端起點 1．2細胞內(nèi)DNA復(fù)制過程 （1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合投影圖） 核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖） 由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)： （2）DNA的復(fù)制過程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。 引物結(jié)合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結(jié)合，確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對。 DNA聚合酶結(jié)合： 子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。 后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈） 子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“5’→3’合成”。 感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。 ［思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？ DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補配對；DNA聚合酶的復(fù)查功能。 ［思考］細胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。 1．3DNA分子復(fù)制的人工控制 解開螺旋：在80～100℃時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。 恢復(fù)螺旋：在50℃左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。 復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。 反應(yīng)場所：PCR儀（自動溫度周期性調(diào)節(jié)）。 ［思考］緩沖液相當(dāng)細胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）1．4PCR的反應(yīng)過程 延伸 復(fù)性 變性 變性：在95℃時DNA解旋 復(fù)性：在50℃時引物與DNA單鏈結(jié)合 延伸：在72℃時合成DNA子鏈（兩個引物間的序列）2．實驗操作 2．1 PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水 2．2 實驗操作步驟 2．3 按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液； （2）將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中； （3）將微量離心管放到PCR儀中； （4）設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。 （5）DNA在PCR儀中大量擴增。 2．4 水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時間。 3．實驗注意事項 3．1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。 3．2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。 3．3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個移液器的槍頭。 3．4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。 4．結(jié)果分析與評價 4．1反應(yīng)液稀釋：取2LPCR反應(yīng)液，添加98L蒸餾水；2．分光光度計調(diào)零：將100L蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計調(diào)整讀數(shù)為零。 4．2將100L反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。 4．3計算：DNA含量＝50光吸收值稀釋倍數(shù) （三）課堂總結(jié)、點評 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段 PCR原理 DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物 DNA的變性和復(fù)性受溫度影響 PCR過程 變性 復(fù)性 延伸 操作步驟 配制PCR反應(yīng)體系 移入離心管 放入PCR 設(shè)置工作參數(shù) DNA擴增 測定含量 稀釋 調(diào)零 測定并讀數(shù) 計算 （四）實例探究 例1 在（ ）的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開 A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃ 解析：蛋白質(zhì)大多不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會變性。 答案：B 例2 關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是（ ） A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5’端延伸DNA鏈 B.DNA復(fù)制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結(jié)合 D.DNA的合成方向總是從子鏈的3’端向5’端延伸 解析：由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3’端即復(fù)制方向由3’端向5’端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補配對原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5’端向3’端延伸。 答案：C 綜合應(yīng)用 例3 下列有關(guān)PCR描述，不正確的是（ ） A.是一種酶促反應(yīng) B.引物決定了擴增的特異性 C.擴增產(chǎn)量按y＝（1＋X）n D.擴增對象是氨基酸序列 E.擴增對象是DNA序列 解析：PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3’端連接脫氧核苷酸，短時間內(nèi)迅速復(fù)制上百萬份的DNA拷貝，其擴增產(chǎn)量為y＝（1＋X）n，y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，x表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，因此答案選D。 答案：D 課后探究 1、PCR與生物體DNA復(fù)制有何區(qū)別？ 2、如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？ ★教后小記 教師在教學(xué)過程中，可以先引導(dǎo)學(xué)生回憶必修2的有關(guān)DNA復(fù)制的知識，在此基礎(chǔ)上，學(xué)生可加深對于PCR原理的認識。對于PCR反應(yīng)過程的教學(xué)，應(yīng)以讀圖識圖為主。教材中反應(yīng)過程圖解詳細的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應(yīng)的三個基本步驟—變性、復(fù)性、延伸；每一步驟的作用。教師在教學(xué)中可以請學(xué)生在讀圖的同時，結(jié)合教科書中的文字說明來加深理解。當(dāng)學(xué)生遇到難以理解的地方時，教師要及時給予解答。