2019-2020年高中生物 5.3血紅蛋白的提取和分離同步訓練（含解析）新人教版選修1.doc

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2019-2020年高中生物 5.3血紅蛋白的提取和分離同步訓練（含解析）新人教版選修1 目標導航　1.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。2.理解緩沖液的組成和作用機理。3.體驗提取生物大分子的基本過程和方法。 一、分離蛋白質(zhì)的基本方法原理 1．蛋白質(zhì)的分離方法——凝膠色譜法 凝膠色譜法也稱做________________，是根據(jù)________________的大小分離________的有效方法。 相對分子質(zhì)量 直徑大小 運動方式 運動速度 運動路程 洗脫 次序 大 ____凝膠顆?？障吨睆剑慌抛柙赺___ 垂直向下移動 ____ 較短 先從凝膠柱洗脫出來 小 ____凝膠顆?？障吨睆?，可以進入顆粒內(nèi)部 垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入凝膠顆粒 ____ 較長 后從凝膠柱洗脫出來 2.緩沖液的作用和組成 (1)作用 在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界________和________對溶液________的影響，維持pH基本不變。 純水的pH因加入少量的強酸或強堿而發(fā)生很大變化。然而，1滴濃鹽酸加入到1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(從1.0010－7 mol/L增到1.0110－7 mol/L)，pH沒有明顯變化。 (2)組成 緩沖溶液通常由________種緩沖劑溶解于水中配制而成，調(diào)節(jié)緩沖劑的____________就可以制得________________________的緩沖液，其類型主要有3種： ①弱酸及其對應鹽，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 ②多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽，如 NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 ③弱堿及其對應鹽，如NH3H2O—NH4Cl。 3．電泳 (1)概念 電泳是指____________在________的作用下發(fā)生________的過程。許多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上________或________。在電場的作用下，這些帶電分子會向著________________的電極移動。 (2)原理 在同一電場下，由于各種分子________性質(zhì)的差異及分子本身________、________的不同，使帶電分子產(chǎn)生________________，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 (3)常用方法 ①____________電泳：由于瓊脂糖本身不帶電荷，所以，各種分子在電場中的遷移速率因各種分子帶電性質(zhì)的差異、分子大小和形狀不同而不同，從而得以分離。 ②________________電泳 加入SDS作用：使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈；與各種蛋白質(zhì)結合形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。 二、粗提取血紅蛋白 1．紅細胞的洗滌 (1)目的：____________，以利于后續(xù)步驟的分離純化。 (2)過程 ：為防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血劑檸檬酸鈉 ：500 r/min，離心2 min，這樣做的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離效果 ：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿 ：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10 min ：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復洗滌 (3)操作提示：洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要，洗滌次數(shù)少，無法除去血漿蛋白，離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離效果。 2．血紅蛋白的____ (1)方法：將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中，加______到原血液的體積，再加40%體積的______，置于磁力攪拌器上充分攪拌10 min。 (2)目的：使紅細胞吸水____，血紅蛋白釋放出來。 (3)原理：滲透作用。 3．分離血紅蛋白溶液 (1)方法 ①將攪拌好的混合液轉移到__________中，以2 000 r/min的速度____10 min。 ②將離心管中的液體部分用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層。 ③將濾液置于分液漏斗中，靜止片刻后，分出下層的紅色透明液體，即為血紅蛋白溶液。 (2)目的：使________與大部分雜質(zhì)分離開，便于后續(xù)純化。 (3)離心后試管中的溶液分為4層，最上面的一層是甲苯層，第二層是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層是血紅蛋白水溶液層，最下層是雜質(zhì)沉淀層。 4．粗分離——透析 (1)原理：______能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。 (2)過程：取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。 (3)目的 ①除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。 ②用于更換樣品的緩沖液。 三、純化蛋白質(zhì) 1．凝膠色譜柱的制作 (1)取長40 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的________，兩端需用砂紙磨平。 (2)柱底部制作：打孔→挖出________→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗將________上部包好。 (3)柱頂部制作：打孔→安裝玻璃管。 (4)將上述三部分按相應位置組裝成一個整體。 2．凝膠色譜柱的裝填 (1)計算：根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需凝膠量 　↓ (2)凝膠________：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸液 　↓ (3)________：將色譜柱垂直固定在支架上 　↓ (4)________：將凝膠懸液一次性裝填入色譜柱內(nèi) 　↓ (5)________：用20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH＝7.0)洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密 3．樣品的加入和洗脫 (1)調(diào)整緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，調(diào)整緩沖液與凝膠面________ (2)________透析樣品：關閉下端出口，用吸管小心將1 mL樣品加到色譜柱頂端 (3)樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi) (4)再調(diào)整________：關閉出口，小心加入20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度 (5)________：打開下端出口，用磷酸緩沖液洗脫 (6)收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集 四、實驗操作提示 1．紅細胞的洗滌：________________________________。 2．凝膠的預處理：_________________________________________________________。 3．色譜柱的裝填：___________________________________________________________。 4．色譜柱成功的標志：________________________。 五、蛋白質(zhì)純度鑒定及實驗結果分析與評價 1．純度鑒定——________________________________ 判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。 2．結果分析與評價 項目 分析 血液樣品的處理 分層____→樣品處理完成 凝膠色譜柱的裝填 放一個與凝膠柱垂直的日光燈→直接檢查； 加入大分子有色物質(zhì)如藍色葡聚糖或紅色葡聚糖，若色帶均勻、狹窄、平整→裝填成功 血紅蛋白的分離 血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨洗脫液緩慢流出→分離成功 知識點一　分離蛋白質(zhì)的基本方法原理 1．利用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)洗脫出來的順序是(　　) ①相對分子質(zhì)量最大的?、谙鄬Ψ肿淤|(zhì)量最小的 ③相對分子質(zhì)量適中的 A．①②③ B．③②① C．①③② D．②①③ 2．凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法，但并非所有的蛋白質(zhì)都可以用此方法進行分離，能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須(　　) A．具有相同的相對分子質(zhì)量 B．相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較大的分子 C．相對分子質(zhì)量不同，但都是相對分子質(zhì)量較小的分子 D．具有不同的相對分子質(zhì)量 知識點二　分離蛋白質(zhì)的實驗操作 3．對在凝膠柱上加入樣品和洗脫的操作，不正確的是(　　) A．加樣前要使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平齊 B．讓吸管管口沿管壁環(huán)繞移動，貼壁加樣至色譜柱頂端，不要破壞凝膠面 C．打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，直接連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫 D．待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，每5 mL收集一管，連續(xù)收集流出液 4．在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關于對樣品處理過程的分析無誤的是(　　) A．洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽 B．洗滌時離心速度過小，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果 C．洗滌過程選用0.1%的生理鹽水 D．透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì) 一、選擇題 1．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷________方向的電極移動(　　) A．相同 B．相反 C．相對 D．相向 2．在血紅蛋白分離過程中，使用緩沖液的作用是(　　) A．維持溶液濃度不變 B．維持溶液酸堿度不變 C．催化蛋白質(zhì)分離過程順利完成 D．無實際意義 3．下列有關提取和分離血紅蛋白的敘述，錯誤的是(　　) A．樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液 B．通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取 C．可通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化 D．可通過SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度 4．凝膠色譜分離法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是(　　) A．改變蛋白質(zhì)分子通過凝膠時的路徑 B．吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度 C．將酶或細胞固定在凝膠中 D．與蛋白質(zhì)分子進行化學反應，從而影響其移動速度 5．下列各項中，除哪項外均為電泳使樣品中各分子分離的原因(　　) A．分子帶電性質(zhì)的差異 B．分子的大小 C．分子的形狀 D．分子的變性溫度 6．下列關于樣品的加入和洗脫的敘述，正確的是(　　) A．先加入1 mL透析后的樣品 B．加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出 C．如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功 D．洗脫時可以用緩沖液也可以用清水 7．凝膠柱制作的順序一般是(　　) ①橡皮打孔?、谕诎佳ā、垩b玻璃管?、苌w尼龍網(wǎng) ⑤蓋尼龍紗?、迣⑾鹌と迦氩ＡЧ堋、呓幽猃埞?、裝螺旋夾?、嘀敳迦氚惭b玻璃管的橡皮塞 A．①③④⑤⑥⑧⑦② B．①②③④⑤⑥⑦⑧ C．①②③④⑥⑤⑧⑦ D．①②③⑦⑥⑤⑧④ 8．凝膠色譜柱制作成功的標志是(　　) A．凝膠裝填緊密、均勻 B．凝膠色譜柱中有氣泡 C．洗脫中，紅色區(qū)帶均勻一致移動 D．洗脫中，紅色區(qū)帶偏向左邊移動 二、簡答題 9．凝膠色譜技術是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果，目前已經(jīng)被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)圖回答問題： (1)a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由__________________________替代。 (3)裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內(nèi)不能有氣泡存在，原因是__________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)若選用Sephadex G－100，則“G”表示_________________________________________，100表示______________。 10．紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題： (1)血紅蛋白提取和分離的過程可分為四步：__________、________、________和________。 (2)實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。 ①加入檸檬酸鈉的目的是____________________________________________________。 ②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________________________、______________、收集血紅蛋白溶液。 (3)洗滌紅細胞的目的是___________________________________________________。 (4)你如何知道紅細胞已洗滌干凈？ ________________________________________________________________________。 (5)分離紅細胞時的離心速度及離心時間分別是__________________________________ __________________________________________。 (6)若離心速度過高和時間過長結果會怎樣？ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (7)將收集的血紅蛋白溶液放在透析袋中進行透析，即樣品的粗分離。 ①透析的目的是_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________； ②透析的原理是_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (8)然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經(jīng)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 樣品純化的目的是____________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 第18課時　血紅蛋白的提取和分離 知識清單 一、1.分配色譜法　相對分子質(zhì)量　蛋白質(zhì)　大于　外面 較快　小于　較慢 2．(1)酸　堿　pH　(2)1～2　使用比例　在不同pH范圍內(nèi)使用 3．(1)帶電粒子　電場　遷移　多肽　核酸　正電　負電　與其所帶電荷相反　(2)帶電　大小　形狀　不同的遷移速度　(3)①瓊脂糖凝膠?、诰郾０纺z 二、1.(1)去除雜蛋白　(2)②離心　③血漿?、芟礈? 2．釋放　(1)蒸餾水　甲苯　(2)漲破 3．(1)①離心管　離心　(2)血紅蛋白 4．(1)透析袋 三、1.(1)玻璃管　(2)凹穴　橡皮塞 2．(2)溶脹　(3)固定　(4)裝填　(5)洗滌平衡 3．(1)平齊　(2)滴加　(4)緩沖液面　(5)洗脫 四、1.洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心 2．沸水浴法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物和氣泡 3．裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流 4．紅色區(qū)帶均勻一致地移動 五、1.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳　2.明顯 對點訓練 1．C　[分子很大，完全不能進入凝膠內(nèi)的任何孔隙的蛋白質(zhì)洗脫出來的時間最短；分子大小適中，能進入凝膠內(nèi)孔隙中孔徑大小相應部分的蛋白質(zhì)，洗脫出來的時間次之；分子很小，能進入分子篩全部孔隙內(nèi)的蛋白質(zhì)，洗脫出來的時間最長。] 聯(lián)想　凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，相對分子質(zhì)量很小，能進入分子篩的全部孔隙，運動速度最慢，路程最長；相對分子質(zhì)量較大的，不能進入凝膠顆粒內(nèi)，運動速度最快，路程最短。所以，蛋白質(zhì)可以按不同順序洗脫出來。 規(guī)律鏈接　凝膠色譜中分子彼此間較易分開的原因 在凝膠色譜中會有三種情況：一是分子很小，能進入分子篩的全部內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應的部分。三類分子彼此間較易分開。 2．C　[若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的，分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠。] 3．C　[打開下端出口，待樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口，在用同樣的方法小心加入適量的20 mmol/L的磷酸緩沖液，然后連接緩沖液洗脫瓶開始洗脫。] 規(guī)律鏈接　血紅蛋白提取與分離過程中的注意事項 1．紅細胞的洗滌 (1)離心速度與離心時間十分重要，離心轉速要低，時間要短，否則白細胞等會一同沉淀，達不到分離的效果。 (2)重復洗滌三次，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法清除血漿蛋白。 2．血紅蛋白的釋放 (1)蒸餾水的作用：使紅細胞的細胞膜和核膜破裂。 (2)甲苯的作用：溶解細胞膜。 3．色譜柱填料的處理 為了加速干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需1～2 h。這種方法不僅節(jié)約時間，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排出膠粒內(nèi)的空氣。 4．凝膠色譜柱的裝填 在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 (1)在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 (2)在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。 5．蛋白質(zhì)的分離 滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液的時間。 4．D　[洗滌紅細胞的目的是去除血漿中除血紅蛋白以外的雜蛋白；洗滌時離心速度過大，時間過長，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果；洗滌過程選用0.9%的生理鹽水。] 達標測試 1．B　[在一定pH作用下，生物大分子中有某些可解離的基團，這些基團會帶上正電荷或負電荷，在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。] 2．B　[分離蛋白質(zhì)時加入緩沖液，其原因是緩沖液在一定范圍內(nèi)能抵制外界酸和堿對反應溶液pH的影響，保持pH基本不變。] 3．B　[血紅蛋白的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。其中樣品處理又包括紅細胞的洗滌、血紅蛋白釋放、分離血紅蛋白溶液等步驟，其目的是獲得血紅蛋白溶液；粗分離即透析，其目的是除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，故B項描述錯誤。] 4．A　[凝膠的種類較多，但每種凝膠內(nèi)部都有孔隙。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子可以進入凝膠內(nèi)部，通過的路程較長，洗脫時從凝膠柱中出來的較晚，相反相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子則可以較早的洗脫出來，從而達到分離蛋白質(zhì)的目的。] 5．D　[電泳是指帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程，樣品分子的帶電性質(zhì)不同、分子的大小和形狀不同都會影響帶電粒子在電場中的遷移速度，與分子的變性溫度無關，故選D項。] 6．C　[加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面齊平，關閉出口之后，用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端。] 7．B　[凝膠柱制作的一般流程是：選擇玻璃管→選擇合適的橡皮塞→打孔→挖凹穴→蓋尼龍網(wǎng)→蓋尼龍紗→將橡皮塞插到玻璃管→接尼龍管→裝螺旋夾→柱頂插入安裝玻璃管的橡皮塞。] 8．C　[洗脫過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。] 9．(1)a　a相對分子質(zhì)量大，無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快　(2)尼龍網(wǎng)和尼龍紗　(3)氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果　(4)凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍　凝膠得水值 解析　用凝膠色譜法分離各種大分子物質(zhì)時，大分子物質(zhì)先洗脫出來，然后是小分子物質(zhì)。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而落后于大分子物質(zhì)洗脫出來。在色譜柱中填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。 10．(1)樣品處理　粗分離　純化　純度鑒定　(2)①防止血液凝固?、诩t細胞的洗滌　血紅蛋白的釋放　(3)去除血漿蛋白　(4)離心后的上清液沒有黃色　(5)低速500 r/min；短時間如2 min　(6)離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度　(7)①去除分子量較小的雜質(zhì)?、谕肝龃苁剐》肿幼杂蛇M出，而大分子則保留在袋內(nèi)　(8)通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去