質粒轉化大腸桿菌.ppt

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質粒轉化大腸桿菌,1、重組質粒的鑒定當質粒的重組或其他載體重組后，通常會發(fā)生質粒的重組失敗，包括質粒的本身環(huán)化。因而要求進行篩選，把重組成功的質粒找出來。在目前常用的質粒和其他載體中含有相應的抗生素抗性基因，若重組成功，或不含質粒的自身環(huán)化，抗生素抗性基因表達，被轉化的大腸桿菌便具備抵抗相應抗生素的能力，可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長傳代。若重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴增質粒和其他載體作準備由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min，而且常用質?？梢栽诖竽c桿菌中增殖達到幾百個拷貝。因此，通過對轉化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短時間內極大的擴增目的質粒。,一、實驗目的,二、實驗原理,通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細菌。這些細菌可使每微克超螺旋質粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質粒，產生5106~2107個轉化的菌落。當質粒與這些大腸桿菌混合后，質粒粘附在大腸桿菌的表面，在42℃時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質粒可通過大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37℃振動培養(yǎng)可使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉化效率。轉化成功的大腸桿菌可以在相應抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。,三、實驗流程：,滅活物/質粒,,轉化大腸桿菌,挑菌,搖菌,菌液PCR,,,,四、實驗方法---凍融法,連接產物滅活70℃，10min,,（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細胞50μl、滅火物10μl,混合物，冰上放置30min,42℃,90sec,冰上2min,加入1000ulLB液體（無抗）,37℃，振蕩1h,離心10000rpm,1min,RT,去上清800μl,留下200μl上清于1.5ul離心管中重懸,涂板,37℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)12h(時間不得超過20h),,,,,,,,,,,1、無菌落，失敗，或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣，失敗，可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿，抗生素濃度太高，失敗。4、出現(xiàn)菌落，符合要求。,（1）,（2）,（3）,（4）,五、結果分析和失敗原因,（1）有菌落，說明轉化成功，但有兩種可能性：其一，質粒自身環(huán)化；其二，重組成功。（2）無菌落，說明實驗沒成功。（3）菌落布滿如苔樣，可能是抗生素濃度不夠或失效。（4）出現(xiàn)大菌斑，大多數(shù)是霉菌污染所致。,1、結果分析,1、平板中的抗生素部分失效，長出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時，培養(yǎng)基太燙，應冷卻到50℃以下加Ka抗生素。2、涂板時來回用力過大，涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱，或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細胞長時間處在常溫狀態(tài)，會嚴重影響其轉化，操作時動作迅速。4、操作時動作過于劇烈，減少對細胞的機械損傷。切記感受態(tài)細胞比較嬌嫩。5、操作過程不規(guī)范，染菌。,2、轉化失敗的原因,六、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備,（1）從LB平板上挑取新活化的E.coliTOP10單菌落于50mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；（2）將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.5左右；（3）將培養(yǎng)液轉入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下4100rpm離心10min。（4）棄掉上清,加入30ml0.1mol/L預冷的CaCl2溶液，重懸，冰上放置15-30min后，4℃下4100rpm離心10min；（5）棄掉上清，加入2ml預冷的0.1mol/L的CaCl，加入無菌甘油300μl，重懸混勻,冰上放置幾分鐘；（6）分裝，每管100μl，液氮冷凍后,保存于-70℃冰箱。,七、挑菌、搖菌,（1）離心管標號（2）每個管內吸入650μlLB+Ka抗生素（3）用牙簽挑取單個菌（4）搖床上搖菌（時間大于8h）,準備：離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素,八、藍白斑篩選原理,藍白斑篩選-----篩選重組子：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等?，F(xiàn)在許多載體都含有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS）。受體菌則含編碼β-半乳糖苷酶C端aa的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有β-半乳糖苷酶表達，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基中形成藍色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。,九、菌液PCR驗證,加樣：easybuffer:2.5μl樣數(shù)DNTP：1.5μl樣數(shù)M13R:1μl樣數(shù)M13F:1μl樣數(shù)easyTaq:0.2μl樣數(shù),,,,混勻、離心,分裝,樣品,跑電泳,跑PCR,混勻、離心,加菌液1μl（酒精燈前）,,,,電泳圖：,謝謝！,