基因工程技術 筆記整理.doc

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基因工程技術：按照人們的愿望，進行嚴密的設計，通過體外DNA重組和轉移等技術，有目的地改造生物種性，使現有物種在較短的時間內趨于完善，創(chuàng)造出新的生物類型。 質粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價閉合環(huán)狀DNA分子cccDNA，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中，它具有自主的復制和轉錄系統(tǒng)。質粒在細胞內的復制一般有二種：緊密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在細胞周 期的一定階段進行復制，通常每個細胞內只含有一個或幾個質 粒分子；后者在整個細胞周期中隨時可以復制，在每個細胞中 有許多拷貝。 質粒的不相容性：利用共同復制系統(tǒng)的不同質粒不能在同一宿主細胞中共存。 從細胞中分離質粒DNA 的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。 溶菌酶：破壞菌體細胞壁；SDS和Triton X-100：使細胞膜裂解。 染色體DNA 通常用于構建基因組文庫和Southern雜交等。 基因組DNA的提取 植物基因組DNA提取：提取緩沖液（Tris.Cl— 保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，異丙醇—沉淀DNA（提染色體），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加鹽，70%乙醇—漂洗。 細菌基因組DNA提?。篠DS，蛋白酶K，氯仿：異戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—調節(jié)離子強度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，異丙醇/無水乙醇—沉淀上清液。 總RNA制備 mRNA的分子結構容易受到RNA酶的攻擊反應而降解，加上RNA 酶極為穩(wěn)定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應嚴格防止RNA 酶的污染并設法抑制其活性，這是實驗成敗的關鍵。儀器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液處理—所有器皿最后硅烷化處理。 RNA酶抑制劑：DEPC--強烈但不徹底，與氨水溶液混合會產生致癌物；異硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他-- RNA酶蛋白抑制劑（RNasin）SDS, 尿素等。 細胞內總RNA制備方法：異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先將組織在液氮中研磨成粉末） 異硫氰酸胍熱苯酚法：異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT與 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)作用使蛋白質變性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎細胞和去除蛋白質，用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。 Trizol法：Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）。 mRNA提取 制備mRNA原理：分離的總RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點，用oligo(dT)纖維素柱分離，當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上樣buffer和洗脫buffer）。溶液中無鹽時要沉淀RNA，必須加鹽NaAC。 瓊脂糖凝膠電泳 DNA凝膠電泳：瓊脂糖-- 分離DNA片段大小范圍廣；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。 瓊脂糖凝膠電泳特性：1.DNA分子大小：DNA分子在一定瓊脂糖濃度下的遷移率；2.瓊脂糖濃度：1.0-1.2%；3.DNA分子構象：超螺旋DNA最快，線狀雙鏈最慢；4.電源電壓：不大于5V/cm，負—正；5.染料：溴化乙錠（EB）--強誘變劑；6.離子強度：0.5*TBE（不能過高，避免buffer發(fā)燙）。 RNA凝膠電泳：RNA分子有很多二級結構，需經變性劑處理，可以破壞RNA中的二級結構。然后，用瓊脂糖凝膠電泳可分級分離不同大小的mRNA分子。 RNA瓊脂糖凝膠電泳方法有三種：乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞（劇毒）瓊脂變性電泳。 DNA限制性內切酶 限制性內切酶：限制性內切酶是指能特異性結合于一段被稱為限制性識別序列的DNA序列之內或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。 I類酶：結合于識別位點并隨機切割識別位點不遠處的DNA；II類酶：由二種酶分子組成的二元系統(tǒng)（核酸酶—切割、甲基化酶—修飾），其識別位點和切割位點是同一位置；III類酶：在識別位點之外切割DNA 分子，然后從底物上解離。甲基化：保護DNA分子，越活躍的地方，甲基化程度越低。 切割性能：回文對稱特異核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。 酶單位：在合適緩沖液和反應溫度下，在20ul反應體積中一小時內完全降解1mg DNA 所需要的量。 載體：把一個有用的目的 DNA片段通過重組DNA 技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具。常見載體：質粒、λ噬菌體、粘粒、BAC、YAC等。 質粒載體的特性：分子量小、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限制性內切酶的單切點；能插入較大的外源DNA片段；具有容易操作的檢測表型。 pBR322、pUC18/19（分子量更小、α-互補原理—藍白篩選、多克隆位點區(qū)MCS）、pBluescript SK(+/-)（MCS）。 乳糖操縱子： α-互補原理：lacZ（β-半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間可以實現互補的現象。 藍白斑篩選：X-gal-----IPTG（乳糖類似物—誘導劑）--------藍色吲哚產物 （當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色）。 λ噬菌體：侵染細菌的病毒（裂解性侵染、溶源性侵染）。 【堿性磷酸酶--活性好, 但較抗熱和去污劑,在去磷酸化反應后很難去除】 細胞轉化（transformation）是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段（E.coli）。 【如需將質粒載體轉移進受體細胞，需誘導受體細胞產生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA.】 感受態(tài)細胞：受體細胞經一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化學試劑）處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進入的細胞狀態(tài)。 【LB培養(yǎng)基不含Amp，設2個對照（防污染）】 提高轉化效率的因素：細胞生長狀態(tài)和密度（剛進入對數生長期）、質粒的質量和濃度（DNA溶液體積不超過感受態(tài)細胞體積的5%）、試劑質量（最高純度）、防止雜菌和雜DNA污染（無菌器皿）。 PCR技術的3個步驟：變性：目的雙鏈DNA在94℃下解鏈；退火：兩種寡核苷酸引物在適當溫度（50℃左右）下雨模板上的目的序列通過氫鍵配對；延伸：TaqDNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成。 PCR反應5要素：引物、模板、酶、dNTPs和Mg2+ 引物設計原則：1.引物長度：（20bp）；2.引物擴增跨度：2kb左右最有效；3.引物堿基：G+C含量40-60%為宜，ATGC分布均勻，不要集中；4、避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補；5.引物3’端的堿基：嚴格要求配對；6.引物中有或能加上合適的酶切位點；7.引物的特異性：與其他序列無明顯同源性；8.擴增產物本身無穩(wěn)定二級結構（以免產生非特異性）；9.引物量：濃度要控制。 模板：可以是DNA或RNA，可以是線狀或環(huán)狀。 TaqDNA聚合酶：活性半衰期為92.5℃（最后加入）。 dNTPs：質量、濃度與PCR擴增效率有關，應保存得當，不好凍融，最好分裝。 Mg2+：對PCR擴增的特異性和產量有顯著影響，濃度過高，特異性降低，出現非特異性；過低，降低TaqDNA聚合酶活性，使反應產物減少。 反應緩沖液：Tris.Cl，KCl，和適當濃度的Mg2+。（BSA、DDT） PCR反應條件：溫度、時間和循環(huán)次數。 溫度：變性：94℃，退火：Tm= 4(G+C)＋2(A+T)，值約低5℃，延伸：72℃。 循環(huán)次數：25-30循環(huán)?！綪CR常見問題：無擴增產物、非特異性擴增、拖尾、假陽性】 實時熒光定量PCR技術：技術是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累通過對 PCR 擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。 檢測模式有：Tagman 探針和SYBR Green I檢測模式。 SYBR Green I 染料方法：是一種結合于小溝中的雙鏈 DNA結合染料，與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。熒光閾值：在熒光擴增曲線上人為設定的一個值。CT 值：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。 Tagman 探針：是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。 RAPD（隨機擴增的多態(tài)性DNA）：運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標記。 原理：利用一系列（通常數百個）不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對所研究基因組DNA進行PCR擴增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態(tài)性，這些擴增產物DNA 片段的多態(tài)性反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性?！綝NA提取+選擇隨機引物—PCR反應—凝膠電泳—圖譜分析】。缺點：圖譜中某些弱帶重復性較差，信息量小，有假陽性結果等等。 差別表達基因分析技術：1.mRNA 差異顯示技術（DD） 2.代表性差示分析技術（RDA）3.抑制性差減雜交技術（SSH）---- 提取目標樣和參照樣；將目標樣與殘照樣雜交得到產物；合并雜交產物；特異性片段擴增 ---- 該方法能使假陽性率降低到6% 4.交互差減RNA 差別顯示技術（RSDD）。 分子雜交相關技術：互補的核苷酸序列通過Watson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子的過程稱為雜交。雜交的雙方是所使用的探針和要檢測的核酸。 根據核酸的性質：DNA和RNA探針；根據是否使用放射性標記物：放射性和非放射性標記探針；根據是否存在互補鏈：單鏈和雙鏈；根據放射性標記物摻入情況：均勻標記和末端標記。 1）雙鏈DNA探針：其合成方法有-- 切口平移法和隨機引物合成法。 切口平移法：當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時，E.coli DNA聚合酶I 就可將核苷酸連接到切口的3’羥基末端。通常使用--[α-32P]dNTP。 隨機引物合成法：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段，合成含有標記核苷酸的DNA鏈。具有聚合活性，沒有5’至3’外切酶活性, 稱為Klenow片段。 2）末端標記DNA探針： 3’末端標記（利用Klenow片段及T4DNA聚合酶） 和DNA 5’末端標記（利用T4多核苷酸激酶PNK）。 AKP堿性磷酸酶—去磷酸化 3）單鏈DNA探針：以M13載體衍生序列為模板，用Klenow片段合成；以RNA為模板，用反轉錄酶合成。 4）Dig標記的核苷酸 分子雜交：分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用標記的探針和被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的DNA或 RNA分子所處的位置。Southern雜交和Northern雜交。 Southern雜交：DNA片段經電泳分離后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。步驟：酶切、DNA片段轉移、預雜交、雜交、顯色反應。 硝酸纖維素濾膜所得的結果背景較低，但易破裂；尼龍膜較耐用，但所得的結果背景較高。硝酸纖維素膜結合DNA依賴高鹽溶液。 DNA轉移方法：毛細管轉移、真空轉移、電泳轉移。 Northern雜交：RNA片段經電泳后，從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后用探針雜交，被檢對象為RNA，探針為DNA或RNA。 影響雜交的因素：核酸分子的濃度和長度、溫度、封閉試劑、離子強度。 變性，酸處理的目的？ 基因的原核表達：原核表達系統(tǒng)由原核表達寄主菌及原核表達質粒組成，優(yōu)點:操作簡單、方便、快速、成本低、產量高、純化容易；缺點：產物多以包涵體形式存在；不含內含子，沒有轉錄及翻譯后加工過程，表達產物不能正常修飾；有些表達的蛋白沒有活性。 基因表達方式：組成型表達（不停的表達目的蛋白）、誘導表達（只有在誘導劑作用下才表達）、融合表達（融合表達標簽）、分泌表達（信號肽）、可溶性表達（E.coli）。 啟動子：RNA聚合酶以很高的親和性結合在基因調控區(qū)域的特定位子，起始RNA合成的序列。（-10區(qū)和-35區(qū)）。 細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動子。 原核表達系統(tǒng)中常見啟動子及其特點：Lac(乳糖啟動子)—來自E.coli，一段有方向的核苷酸序列，阻止RNA聚合酶的結合而抑制轉錄；Trp(色氨酸啟動子)----阻遏蛋白必須與色氨酸結合才有活性，阻止轉錄；Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)----由Lac和Trp人工構建的雜合啟動子，受Lac阻遏蛋白的負調節(jié)；PL (噬菌體的左向啟動子)----左向轉錄啟動子，受溫度誘導（45℃）、T7噬菌體啟動子----來自T7噬菌體，具有高度特異性，只有T7RNA聚合酶才能使其啟動轉錄，從而得到表達。T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶。 特點：啟動子的作用要強；需表現低水平的基礎表達活性；具有簡便和廉價的可誘導性。 終止子：真核基因或操縱子的3’端往往有特定的具有終止轉錄功能的核苷酸序列。 誘導劑：當有誘導物存在時，誘導物與阻遏蛋白結合，使其構象發(fā)生變化，從而阻遏蛋白從DNA分子上脫落下來，RNA聚合酶進入啟動子區(qū)，可誘導基因的轉錄。 T7表達系統(tǒng)質粒：pET-3—52、His-Tag(6 x His Tag), pET-41、42、49還含有GST-Tag， kam+ or Amp+ 抗性、His-Tag(6 x His Tag）。 pET質粒：不移碼，不改變基因的閱讀框架。多克隆位點BamHI。 pGEX系：GST（谷胱甘肽S轉移酶）基因融合表達質粒。Amp+，N-端GST ，Thrombin(凝血酶) or Factor Xa蛋白酶切位點。 GST融合表達蛋白的純化原理：選擇能識別并特異性結合GST的特定配體，其中GST的底物－－谷胱甘肽是較佳的候選對象，兩者結合后用還原型谷光苷肽的洗脫緩沖液競爭洗脫表達蛋白。。 pBAD系列：His-Tag(6 xHis), Amp+。 pDH2：6His tag,Amp+，ColE1復制起點，IPTG誘導表達。 稀有密碼子：有些在真核細胞中常使用的而在原核細胞中很少使用的密碼子。 原核表達中可能遇到的問題及影響因素：基因特性。 基因含稀有密碼子（無蛋白表達）、基因GC含量（超過70%會降低蛋白表達水平）、基因或蛋白大小（介于5KD和100KD之間）、蛋白親疏水性（親—表達量高，疏—難表達）、基因二級結構（抑制翻譯的起始）、信號肽（疏水性或毒性，應清除）、表達蛋白比預計的小或用其他小的條帶（提前終止，可低溫誘導、基因改造）、基因毒性（細胞生長困難，應低溫低濃度誘導）、質粒不穩(wěn)定性（用低溫高濃度抗生素）、目的mRNA和蛋白不穩(wěn)定而表達量低（低溫長時表達）、包涵體（為變性的表達蛋白）、培養(yǎng)基pH。表達不出來時首先想到換菌株。 構建原核表達系統(tǒng)，考慮3大因素：表達載體、宿主菌株、表達誘導條件。 His tag融合蛋白純化的原理：利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子Ni2+ ，Zn2+， Cu2+ ，Co2+，Fe3+發(fā)生特殊的相互作用，從而把富含這類氨基酸的蛋白質吸附，達到分離的目的。 洗脫目的蛋白有幾種方式：咪唑（條件最溫和）、pH 以及EDTA。 TCA（三氯乙酸）除去鹽酸胍：沉淀鹽酸胍、離心、乙醇溶解、離心，得到沉淀為洗脫蛋白，用尿素溶解、透析后保存。 基因的真核表達系統(tǒng)： 穿梭載體：既能在原核細胞中復制，也能在真核細胞中復制的載體。 Western blot（免疫印跡）：將蛋白質凝膠電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質檢測技術。 原理：蛋白質混合樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳使蛋白質按分子大小分離，將分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相載體膜（NC、PVDF膜）上用無關蛋白質封閉液封閉膜的非特異性位點，加入特異性抗體后膜上的目的蛋白與一抗發(fā)生特異性的免疫結合反應，洗滌后再加入能與一抗發(fā)生免疫結合反應的酶標二抗，最后通過二抗上標記酶的性質進行檢測，即根據底物顯色的顏色及深淺來探測膜上印跡蛋白抗原的存在與否及含量多少。 辣根過氧化合酶（HRP）：來源于植物，用于動物性樣品的檢測（目的是消除樣品中內源性酶的干擾，降低背景）。 堿性磷酸酶（AP）：來源于動物牛小腸，用于植物性樣品的檢測，（目的是消除樣品中內源性酶的干擾，降低背景）。 硝酸纖維素（NC）膜：其結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，很脆、易破，但是結合蛋白效率比PDVF高。 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：疏水性，不易破，結合蛋白較牢固，可結合小片段蛋白。 SDS-PAGE中SDS的作用：強陰離子去污劑使蛋白質變性、亞基解離，破壞蛋白質的四級結構?！镜鞍踪|在電泳分離時，其遷移率主要取決于蛋白質本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)】。 酶標二抗：根據使用的第一抗體選擇，如第一抗體為兔抗體，則可使用羊抗兔IgG抗體，若為鼠源抗體，則可使用羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體。 Western blot實驗步驟：1.SDS-PAGE電泳2.電轉移—濕轉法：將膜、膠、濾紙整個組合完全浸入有鉑絲電極的轉移緩沖液中的蛋白原位電轉移體系。膠正膜負，（-）--> （+）。 Southern blot 地高辛法—轉膜----UV交聯(lián)（紫外交聯(lián)原理）：紫外照射使DNA和RNA的一小部分胸腺嘧啶（T）殘基與膜表面帶正電荷的氨基基團之間形成共價交聯(lián)。 免疫球蛋白（Ig）：是指存在于人和動物血液(血清)、組織液及其它外分泌液中的一類具有相似結構的球蛋白。 抗體（Ab）：動物機體受到抗原物質的刺激后, 由B淋巴細胞轉化成的漿細胞產生的, 能與相應抗原發(fā)生特異性免疫結合反應的免疫球蛋白。 抗原（Ag）：能刺激機體產生抗體和致敏淋巴細胞（免疫原性）并能與之發(fā)生特異性免疫反應（反應原性）的物質。 抗原決定簇：存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的特殊化學基團，是與抗體結合的位點。決定著抗原與抗體發(fā)生特異結合的能力。 ELISA：把抗原、抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機地結合在一起一種免疫學技術。 包被：抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。 常用的標記基因和選擇基因：生化標記基因、抗性標記基因、營養(yǎng)標記基因。 生化標記基因：其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，導入植物24-48小時內就可以檢測結果，迅速對轉基因程序的有關因素進行評價和優(yōu)化，獲得基因表達水平、載體等信息。 常用基因：β-半乳苷酶基因（lacZ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰轉移酶基因（CAT）、熒光素酶基因（Luc）、花青素基因（Ant）、綠色熒光蛋白基因（GFP）。 氯霉素乙酰轉移酶（CAT）基因：抑制蛋白質生物合成。 應用原理：真核生物沒有Cat，Cat轉化的植物細胞具有對氯霉素的抗性，通過Cat的活性檢測分析外源基因的表達?；钚詸z測：反應底物乙酰CoA.方法：硅膠G薄層層析法、DTNB分光光度法。 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）：染色原理--Gus 可以水解葡糖苷酸，形成葡糖醛酸（蘭色）。 熒光素酶（Luc）基因：在ATP存在下催化D-熒光素的氧化反應生成氧化熒光素和黃-綠色光。這是一種對植物組織沒有傷害的檢測方法。 花青素（Ant）基因：轉入這些基因后，可以在植物組織上生成紅色的花青素斑點。此基因不需任何底物就可以檢測，但使用局限性大。 綠色熒光蛋白（GFP）基因：是海洋生物水母體內的一種發(fā)光蛋白，經過改造后用于做植物的標記基因，基因產物在蘭色光或紫色光下可見綠色熒光。 抗性標記基因：抗生素抗性基因、重金屬抗性基因、代謝抗性基因。 抗生素抗性基因：氨芐青霉素抗性基因（Apr）、四環(huán)素抗性基因（Tet r）、氯霉素抗性基因（Cm r）、卡那霉素抗性基因（Kanr）、G418抗性基因（G418r）、潮霉素抗性基因（Hygr）、 新霉素抗性基因（Neor）。 篩選基因：選擇的基本原理：使未轉化的組織或細胞，在含有選擇劑的培養(yǎng)基上新陳代謝受阻而停止生長，最后死亡。 重金屬抗性基因：銅、鋅、鎘抗性基因。 代謝抗性基因：抗除草劑基因。 農桿菌介導轉化法：普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤或發(fā)狀根。 原理：根癌農桿菌和發(fā)根農桿菌細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中?！救藗儗⒛康幕虿迦氲浇涍^改造的T-DNA區(qū)，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株】。 Ti質粒：根癌農桿菌細胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子。溫度低于30℃？ Ti質粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質粒上的冠癭堿分解基因產物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。 6大功能區(qū)：致癌區(qū)、冠癭堿合成區(qū)、冠癭堿分解區(qū)、Ti質粒接合轉移區(qū)、毒性區(qū)、DNA復制區(qū)。 T-DNA：在致癌區(qū)和冠癭堿合成區(qū)的兩側存在著一個24 bp直接重復序列，由這三部分所構成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。T-DNA 區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達。 Vir區(qū)：毒性區(qū)，控制根癌農桿菌附著于植物細胞和Ti質粒進入細胞有關部位。VirE, VirD, VirC, VirG, VirB, VirA（最先激活）。 根癌農桿菌對高濃度的創(chuàng)傷誘導分子，即一些酚類化合物具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導分子的刺激，Ti質粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達。 右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉移到植物細胞。而左邊界的缺失，僅會影響DNA合成過程的終止。 基因槍介導法轉化：將核酸直接發(fā)送至細胞內的物理學方法。原理：利用火藥爆炸或高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。 材料：目的基因、受體組織（愈傷組織）、基因槍轟擊金粉包埋試劑盒。 高壓氣體—可裂膜— 子彈載膜 — 子彈—擋網（阻擋可裂膜及載膜的碎片）—培養(yǎng)皿—受體組織 [此文檔可自行編輯修改，如有侵權請告知刪除，感謝您的支持，我們會努力把內容做得更好] 最新可編輯word文檔