工業(yè)用溶菌酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)要編制說明

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《工業(yè)用 溶菌酶 》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 簡(jiǎn)要 編制說明 一、 工作簡(jiǎn)況 （一）任務(wù)來源、起草單位、起草人 本標(biāo)準(zhǔn)由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院組織上報(bào)，被列入工業(yè)和信息化部 2012 年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃， 計(jì)劃名稱為《工業(yè)用溶菌酶》， 項(xiàng)目編號(hào) 2012本標(biāo)準(zhǔn)由中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出， 全國食品 標(biāo)準(zhǔn)化中心 歸口 。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位略。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人略。負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)資料查詢、收集及對(duì)比，檢測(cè)方法的驗(yàn)證比對(duì)，樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)整理，標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明的起草、撰寫，行業(yè)內(nèi)征求意見，組織標(biāo)準(zhǔn)的初審討論會(huì)及標(biāo)準(zhǔn)報(bào)送等。 （二）簡(jiǎn)要起草過程 標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)下達(dá)后，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院針對(duì)制定工業(yè)用溶菌酶行業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)的具體工作進(jìn)行了認(rèn)真研究，確定了總體工作方案， 于 2012 年 12 月組建了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組 。起草工作組 首先 查閱相關(guān)的國內(nèi)外技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)資料，在參照國際和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合目前國內(nèi)市場(chǎng)產(chǎn)品的實(shí)際情況，初步確定了產(chǎn)品的質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)和相應(yīng)的試驗(yàn)方法，形成了標(biāo)準(zhǔn)草案 （第一稿） 。 2013 年 5 月，工作組在北京召開 第一次 討論會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行討論研究， 綜合各方意見，對(duì)一些尚存在異議的內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步整理 ， 修改成 標(biāo)準(zhǔn)草案 （第二稿），同時(shí) 確定了進(jìn)一步的對(duì)比驗(yàn)證工作 ， 2013 年 6 月～ 2014 年 4 月，起草組完成樣品的搜集，測(cè)定底物、標(biāo)準(zhǔn)品的購置、轉(zhuǎn)化及試驗(yàn)方法的驗(yàn)證調(diào)整工作。 2014 年 5 月，工作組在北京召開 第二次 討論會(huì) ， 經(jīng)過大家的認(rèn)真、細(xì)致的討論研究，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中涉及的主要關(guān)鍵問題達(dá)成共識(shí)， 會(huì)后 又經(jīng) 多次 溝通研究，并 于 2015 年 11 月 修改 形成征求意見稿，向行業(yè)內(nèi)公開征集意見 。 二、 對(duì)主要條款的說明 （ 一 ） 主要內(nèi)容 據(jù)起草工作組調(diào)研和查閱，目前 菌酶）和 1992）酸鹽溶菌酶）、日本食品添加劑公 定書第八版 s 品添加劑溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范） 及 原衛(wèi)生部2010公告 均已公布了溶菌酶的質(zhì)量規(guī)格 要求 。 質(zhì)量規(guī)格特指鹽酸鹽溶菌酶； 限定蛋清來源，給出酶活力測(cè)定方法，不限工藝，也沒有給出特定質(zhì)量規(guī)格；日本公定書針對(duì)溶菌酶產(chǎn)品，工藝上涵蓋原衛(wèi)生部公告的溶菌酶產(chǎn)品，因此，本標(biāo)準(zhǔn)制定綜合考慮上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)給出本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求。對(duì)比情況見附表 1、附表 2。本標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容說明如下： 本標(biāo)準(zhǔn)編寫符合 規(guī)定。 1. 酶活力 酶活力對(duì)于酶制劑產(chǎn)品即是性能指標(biāo)也相當(dāng)于鑒別指標(biāo)。 據(jù)酶活力定義，直接測(cè)定計(jì)算溶菌酶活力，對(duì)活力大小沒有給出限值； 對(duì)鹽酸鹽工藝的溶菌酶，以純度指標(biāo)表達(dá)相對(duì)酶活，并規(guī)定純度指標(biāo) ≥95%，原衛(wèi)生部 2010公告兩個(gè)指標(biāo)全部規(guī)定，但酶活力指標(biāo)的規(guī)定單位為企業(yè)申報(bào)的方法及單位。本標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為活力指標(biāo)與純度指標(biāo)沒有必要同時(shí)設(shè)定， 活力測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)單，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)酶的使用，因而酶活力采納 定義及計(jì)算，試劑的使用及溶液的配 制，考慮操作的方便，給出細(xì)微調(diào)整。 一個(gè)溶菌酶活力單位定義為 25℃ ， 件下，使用溶壁微球菌懸濁液在 450每分鐘引起吸光度變化為 溶菌酶的量。直接采納 活力單位定義。 2. 水分 原衛(wèi)生部 2010公告， 日本公定書對(duì)溶菌酶的水分要求均限定在 ≤6%（固體），本標(biāo)準(zhǔn)與之保持一致。檢測(cè)方法采用國標(biāo) 品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。 3. 灰分 與原衛(wèi)生部公告一致固體 ≤液體 ≤檢測(cè)方法采用國標(biāo) 品安全國家標(biāo) 準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》。 4. 衛(wèi)生部公告值固體產(chǎn)品 體產(chǎn)品 本規(guī)定≥于該指標(biāo)與工藝有關(guān)，且溶菌酶在酸性條件下化學(xué)性質(zhì)、熱穩(wěn)定性均較好，且該指標(biāo)與安全性無直接關(guān)系，因此本標(biāo)準(zhǔn)綜合考慮 定在 范圍內(nèi)。溶液測(cè)定 5. 抑菌作用 在目前市場(chǎng)上溶菌酶有微生物發(fā)酵、蛋清提取等不同來源，來源不同抑菌 作用 也差別很大。為了確保溶菌酶的質(zhì)量，在《溶菌酶》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，增加定性抑菌試驗(yàn)檢測(cè) 。 抑菌環(huán)直徑＞ 6 判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑≤ 6 為無抑菌作用。 2 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用，判為合格。 6. 食品安全要求 應(yīng)符合 國家相關(guān) 規(guī)定 。 7. 酶活力的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)草稿中酶活測(cè)定方法等同轉(zhuǎn)化 方法，但實(shí)驗(yàn)室在驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)直接按 法獲得酶活測(cè)定結(jié)果，測(cè)定底物濃度與儀器初始濃度存在不匹配的問題，且實(shí)驗(yàn)過程中必須規(guī)定相關(guān)細(xì)節(jié)才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、一致性。因此，本標(biāo)準(zhǔn)中的酶活測(cè)定方法參照 測(cè)定方法做適當(dāng)調(diào)整，具體調(diào)整如下： ——測(cè)定用底物：為了保證酶活測(cè)定的準(zhǔn)確性及一致性，必須指定測(cè)定用底物，其中定使用 壁微球菌，底物配制時(shí)按干菌粉給出配制方法及初始底物溶液吸光值； 接指定 同等分析效果的產(chǎn)品。作為一般企業(yè)或質(zhì)檢機(jī)構(gòu) 種購進(jìn)手續(xù)繁瑣，且存在被告知為國內(nèi)限制購入產(chǎn)品而無法購得的可能。 活菌制品，價(jià)格昂貴，且為一次性使用產(chǎn)品，對(duì)于企業(yè)連續(xù)測(cè)定成本較高。為了便于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后測(cè)定方法的有效執(zhí)行，起草組委托食發(fā)院菌種中心引進(jìn) 種，并接種培養(yǎng)配制成不同濃度，配合起草組各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 法的有效轉(zhuǎn)化。起草過程中有關(guān)單位提出，菌種的接種培養(yǎng)及稀釋度的控制專業(yè)性較強(qiáng)，如果直接要求菌種中心提供合適濃度的菌懸液，又存在運(yùn)輸困難且由于運(yùn)輸、儲(chǔ)存條件的變化造成菌液不穩(wěn)定的情況。因此，本標(biāo)準(zhǔn)制定也考慮自制標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定用菌粉的可能。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，文本給出 號(hào)及對(duì)應(yīng) 種編號(hào)，同時(shí)考慮給出 粉編號(hào)。日本也是制定本國菌種編號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)酶編號(hào)。 ——底物溶液： 空氣調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，底物溶液的吸光度， 450讀數(shù)應(yīng)為 吸光度降低的速度應(yīng)在 位 /標(biāo)準(zhǔn)以磷酸鹽緩沖液調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，然后測(cè)定底物溶液的吸光度， 450讀數(shù)應(yīng)為 ——酶活力測(cè)定步驟：增加 “3內(nèi)初始吸光度值變化應(yīng)小于等于 ，方可開始測(cè)定 ”，確保底物溶液的穩(wěn)定且沒有受到溶菌酶的污染；增加 “反應(yīng) 1穩(wěn)定，計(jì)算時(shí)忽略最初 1讀數(shù) ”，以保證酶活測(cè)定 在有效的線性范圍內(nèi)，保證酶活測(cè)定的準(zhǔn)確性。 附表 1：國內(nèi)外溶菌酶質(zhì)量規(guī)格指標(biāo)對(duì)照表 項(xiàng)目 標(biāo)準(zhǔn) 本標(biāo)準(zhǔn) 原 衛(wèi)生部 2010公告 日本公定書 第八版 （溶菌酶） 992（鹽酸鹽溶菌酶） 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于從雞蛋清中提取、精制等工藝制得的工業(yè)用溶菌酶 用離子交換樹脂從雞蛋清中提取溶菌酶，然后經(jīng)洗脫、離心過濾、低壓反滲透過濾、巴氏殺菌制得液體型溶菌酶產(chǎn)品；將液體型溶菌酶進(jìn)行噴霧干燥制得粉末型溶菌酶產(chǎn)品 能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁物質(zhì)的一種酶制劑，來源于蛋清，用堿性水溶液或鹽溶液處理后用樹脂純化，或用柱 純化，或樹脂純化后再結(jié)晶，或加鹽處理 從雞蛋蛋清中提取的，由 129 個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量大約為 14000，有酶活性 ，可以水解細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌的外膜中的連接 （ 1；通常以鹽酸鹽型的形式獲取，用于食品加工。必須符合食品加工處理所用酶制品的通用技術(shù)指標(biāo) 性狀 白色至淡黃色粉末；淺 黃色至深褐色液體 白色至淡黃色粉末；淺黃色至深褐 色液體 無味白色粉末 白色無味粉末 鑒別 — — B： 酸鹽緩沖液于 279281有最大吸收 A：可溶于水，不溶于有機(jī)溶劑和濃鹽溶液 B： 2500溶液，紫外吸光度值252281量測(cè)定（純度） — ≥95% — ≥95% 溶液透明度 — — ≥ 51%溶液，要時(shí)可用稀鹽酸調(diào) — 體） ≥200） 分， % ≤6（固體） ≤6（固體） ≤體） ≤6（固體） 總干物質(zhì) — ≥94%； ≥22%（液體） — — 項(xiàng)目 標(biāo)準(zhǔn) 本標(biāo)準(zhǔn) 原 衛(wèi)生部 2010公告 日本公定書 第八版 （溶菌酶） 992（鹽酸鹽溶菌酶） 酶活力 符合聲稱 ≥07g； ≥9×106g 以干基計(jì)酶活性不小于 灰分 ， % ≤體） ≤體） ≤體） ≤體） — ≤菌作用 合格 — — — 氮， % — ， % — ≤體） ≤， % — ≤ ≤表 2： 國內(nèi)外溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對(duì)照表 標(biāo)準(zhǔn) 項(xiàng)目 本標(biāo)準(zhǔn) 日本公定書第八版（溶菌酶） 中國藥典 （ 水分 ， % 取樣 膠減壓 2 小時(shí) 減壓干燥 酶活力 修改采用始吸光度 照藥典） 比濁法，以溶壁微球菌培養(yǎng)液為底物，溶菌酶可以溶解溶壁微球菌，使吸光度降低，且其降低程度與溶菌酶的活性成正比。緩沖液 25℃ ）底物溶液球菌濃度 30～4000 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液濃度 1mg/將1色皿放入分光光度計(jì)，調(diào)整吸光度零點(diǎn)；吸 物溶液于比色皿；最初 450 準(zhǔn)制備液加入底物溶液，充分混合。記錄 3吸光度的降低，每 15s 記錄一次吸光值，吸光值得變化應(yīng)呈線性，每分鐘的變化范圍應(yīng)在 復(fù)操作測(cè)定樣品溶液 . 1 個(gè)溶菌酶活力單位定義為 25℃， 件下，使用溶壁微球菌懸濁液在 450每分鐘引起吸光度變化為 溶菌酶的量。 分析 1 分鐘后穩(wěn)定，計(jì)算時(shí)忽略最初 1 分鐘的讀數(shù)。用曲線的線性部分（通常在后 2 分鐘）確定每分鐘吸光度變化的平均值。 精確稱取相當(dāng)于 50力效能的樣品（以干基計(jì)）用 酸緩沖液配制成一定濃度的樣品溶液；用真空干燥器烘干 標(biāo)樣 2 小時(shí)，精確稱取相當(dāng)于 50力效能的標(biāo)準(zhǔn)參考酶，用 酸緩沖液配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取3物溶液至試管 35℃ 預(yù)熱3物溶液，樣品溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液 35℃ 預(yù)熱 3確吸取 3熱過的溶液至試管中 35℃ 反應(yīng)10640定吸光度，計(jì)算酶活力 A ????00樣品質(zhì)量酶標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量活力底物懸浮液的制備 稱取溶酶小球菌 30?40磷酸鹽緩沖液 (1研缽內(nèi)研磨 3 分鐘，再加磷酸鹽緩沖液 (量，使總體積約為 100懸浮液于 25±時(shí)，在 450波長(zhǎng)處測(cè)得的吸收度為 用前配制 )。 測(cè)定法 精密量取 25±的底物懸浮液 3 1色池中，在 450波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，作為零秒的讀數(shù) A，然后精密量取 25±供試品溶液 當(dāng)于溶菌酶 加到上述比色池中，迅速混勻，用秒表計(jì)時(shí) ,至 60 秒時(shí)再測(cè)定吸收度 A；同時(shí)精密量取磷酸鹽緩沖液(法操作，做為空白試驗(yàn)，測(cè)得零秒 的讀數(shù) A'及 60 秒的讀數(shù) A'。 活力單位定義 在室溫 25℃ 、 ，在波長(zhǎng) 450，每分鐘引起吸收度下降 一個(gè)酶活力單位 灰分 ， % — 灼燒殘?jiān)? 溶液 — 溶液 1%水溶液 抑菌作用 抑菌環(huán)試驗(yàn) — — —